一种AscI限制性内切酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种AscI限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：步骤一、合成AscI.M

【技术实现步骤摘要】
一种AscI限制性内切酶的制备方法


[0001]本专利技术属于分子生物学和细胞工程
，具体涉及一种AscI限制性内切酶的制备方法。

技术介绍

[0002]细菌防御系统的发现和对其分子机制的深入研究，推动了生物学工具的发展，甚至整个生命科学领域革命性的进步。比如：细菌限制
‑
修饰系统中限制性内切酶的发现，引发了基因工程的革命，成为分子克隆的必备工具。限制性修饰系统(RM system)广泛存在于超过90％的细菌和古细菌中。为保护自身DNA不被裂解，细菌通过甲基转移酶对自身DNA腺嘌呤或胞嘧啶进行甲基化修饰，限制性内切酶可切割未被修饰的噬菌体基因组，阻止噬菌体DNA复制。
[0003]目前Ⅱ型限制性内切酶被广泛应用于基因工程中。AscI是分枝杆菌(Arthrobacter species)体内的一种typeII型限制性内切酶，特异性的识别双链DNA中的“GGCGCGCC”序列并分别在双链5
’
端之后第二个G残基进行切割(GG^CGCGCC)，切割后的片段具有黏性末端，是遗传及基因工程上实用性较高的限制性内切酶种类。然而，野生型大肠杆菌中AscI酶切位点并没有被甲基化保护，因此传统的大肠杆菌中限制性内切酶的制备方法繁琐需要多个步骤：
[0004]1、将带有位点特异性甲基化酶基因的重组载体转入大肠杆菌中，获得具备基底甲基化保护的重组菌；
[0005]2、制作具备基底甲基化表达的重组菌感受态细胞；
[0006]3、将融合了纯化标签的限制性内切酶蛋白表达质粒转入具备基底甲基化表达的重组菌感受态细胞中；
[0007]4、获得阳性单克隆，培养进行限制性内切酶的表达。
[0008]目前尚无国内外文献介绍限制性内切酶AscI的重组表达与纯化方法。因此，提供一种高表达量、低成本、流程简便的高效制备AscI限制性内切酶的方法具有重要意义。

技术实现思路

[0009]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种AscI限制性内切酶的制备方法，在大肠杆菌中构建AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统，通过密码子优化来调整修饰酶AscI.M与限制酶AscI.R的表达量，只需构建一个质粒即可实现两种蛋白等量并同步表达，操作流程简化，成功率高。
[0010]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]本专利技术提供一种AscI限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：
[0012]步骤一、合成AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统的编码基因，构建至原核表达载体，获得重组载体；
[0013]步骤二、将所述重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，获得具备表达并纯化的
AscI限制性内切酶重组菌；
[0014]步骤三、摇瓶培养进行AscI限制性内切酶的诱导表达与纯化。
[0015]进一步地，AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统的编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。
[0016]进一步地，步骤一中经密码子优化AscI.M和AscI.R的氨基酸序列，得到AscI.M和AscI.R的编码基因，以基因合成的方式合成AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统。
[0017]进一步地，AscI.M的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，AscI.R的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，AscI.M编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，AscI.R编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
[0018]进一步地，AscI.R编码基因的DNA序列还含有纯化标签序列；可选地，纯化标签序列为6
×
His标签序列。
[0019]进一步地，步骤一具体为：将AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统的编码基因，通过NcoI和XhoI酶切位点插入至原核表达载体。
[0020]进一步地，所述原核表达载体为pET28a载体。
[0021]进一步地，所述大肠杆菌感受态细胞包括大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
[0022]进一步地，所述重组载体还包括两个T7启动子。
[0023]进一步地，将AscI限制性内切酶重组菌进行诱导表达后，通过亲和纯化层析进行AscI的纯化。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0025]本专利技术提供一种AscI限制性内切酶的制备方法，在大肠杆菌中构建AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统，通过密码子优化来调整修饰酶AscI.M与限制酶AscI.R的表达量，只需构建一个质粒即可实现两种蛋白等量并同步表达；并利用AscI.R末端融合的纯化标签就可以根据需要实现限制性内切酶AscI的快速分离纯化。本专利技术的制备方法能够在较短时间内制备得到高纯度、高活性的AscI限制性内切酶，操作流程简化，成功率高，具有广阔的市场前景。
附图说明
[0026]图1为本专利技术的一个实施例的简要操作流程图；
[0027]图2为实施例3中经过纯化后的AscI蛋白的SDS
‑
PAGE图；
[0028]图3为实施例4中的酶切实验后的琼脂糖凝胶电泳图，其中Marker为分子梯度，AscI+ClaI(N)为第一组反应，AscI为第二组反应，AscI(M)+ClaI(N)为第三组反应；N代表限制性内切酶购自NEB，M代表限制性内切酶购自武汉莫纳生物；
[0029]图4为含AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统的重组载体图谱。
具体实施方式
[0030]为进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本专利技术作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本专利技术，而非对本专利技术的限定。
[0031]实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
[0032]本专利技术的一个具体实施方式的构建、表达及纯化的流程图如图1所示。
[0033]实施例1含AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统的重组菌株的构建
[0034]1)构建含AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统的重组载体
[0035]本实施例中，AscI.M的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，AscI.R的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。首先，两个序列在设计时排除了AscI酶切位点，在AscI.R序列的3
’
端加入6
×
HIS纯化标签，并经过了密码子优化，优化后的AscI.M编码基因的DNA序列如SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种AscI限制性内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、合成AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统的编码基因，构建至原核表达载体，获得重组载体；步骤二、将所述重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，获得具备表达并纯化的AscI限制性内切酶重组菌；步骤三、AscI限制性内切酶的诱导表达与纯化。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统的编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，经密码子优化AscI.M和AscI.R的氨基酸序列，得到所述AscI.M和AscI.R的编码基因，以基因合成的方式合成所述AscI.M
‑
R限制
‑
修饰系统。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述AscI.M的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述AscI.R的氨基酸序列如SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：何腾飞，齐金才，柳伟强，郭鑫缘，许映冲，杨平，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：