一种提高引导编辑系统碱基编辑效率的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种提高引导编辑系统碱基编辑效率的方法。本发明专利技术为了进一步提高引导编辑系统的编辑效率，在PE

【技术实现步骤摘要】
一种提高引导编辑系统碱基编辑效率的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种提高引导编辑系统碱基编辑效率的方法。

技术介绍

[0002]2019年，David Liu实验室新开发的一种多功能基因组编辑技术，即引导编辑(Prime editing，PE)，该技术可以在不需要双链DNA断裂或供体DNA模板的情况下，精确实现12种类型的碱基替换、小的插入和缺失。PE系统的最小组成是一个Cas9切刻酶(Cas9 nickase，Cas9n)与莫洛尼小鼠白血病病毒逆转录酶(M
‑
MLV reverse transcriptase，M
‑
MLV RT)，以及一个引导编辑的向导RNA(prime editing guide RNA，pegRNA)。pegRNA包含一个指定目标位点的间隔区域、一个单导RNA(single
‑
guide RNA，sgRNA)支架和一个3
’
延伸。其中3
’
延伸包含一个与DNA间隔区域的一部分互补引物结合位点(primer binding site，PBS)，以及一个编码所需的编辑和下游基因组序列RT模板。2021年，一种工程化的pegRNA(engineered pegRNA，epegRNA)将结构化的RNA基序整合到pegRNA的3
’
端，将人类细胞中的引导编辑效率提高了3～4倍。
[0003]植物中大多数靶位点的PE编辑效率远低于人类细胞中20％～70％的编辑效率。近年来，主要包括优化PE成分在内的多项工作已被用于进一步提高引导编辑在作物中的应用。例如，利用多顺反子tRNA和核糖酶促进pegRNA在玉米中的表达，在水稻中引入与N端逆转录酶
‑
cas9n融合蛋白协同的RT模板进行多核苷酸替换，以及在水稻和小麦中去除M
‑
MLV RT的核糖核酸酶H结构域并加入具有核酸伴侣蛋白活性的病毒核衣壳蛋白，均可增加PE的灵活性和适用性。然而，经过上述各项改进后，在稳定的转基因植株中，PE的平均效率依然不高。如何提高PE的效率，尤其是在农作物的稳定转化层面上仍具有挑战性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的一个目的是提供一种成套系统。
[0005]所述成套系统包括融合蛋白、esgRNA和pegRNA；
[0006]所述融合蛋白依次包括反转录酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白；
[0007]所述esgRNA靶向MLH1基因靶点序列；
[0008]所述pegRNA依次包括esgRNA
’
、逆转录模板序列(RT序列)、引物结合位点序列(PBS序列)、连接序列和tevopreQ1基序；所述esgRNA
’
靶向目标基因靶点序列。
[0009]上述成套系统中，所述esgRNA依次由MLH1基因靶点序列和esgRNA骨架组成。
[0010]进一步的，所述esgRNA为带有tRNA的esgRNA，所述tRNA为将序列12第1
‑
77位中的T替换为U后得到的RNA分子。所述esgRNA骨架为将序列7第11368
‑
11453位中的T替换为U后得到的RNA分子。
[0011]所述esgRNA的个数可为1个或2个或多个。
[0012]所述MLH1基因序列如序列13所示。
[0013]更进一步的，所述esgRNA为2个，分别记作esgRNA1和esgRNA2，所述esgRNA1中的靶点序列如序列12第78
‑
97位所示，所述esgRNA2中的靶点序列如序列12第261
‑
280位所示。
[0014]上述成套系统中，所述pegRNA依次由目标基因靶点序列、esgRNA骨架、RT序列和PBS序列、连接序列和tevopreQ1基序组成。
[0015]所述esgRNA骨架为将序列7第11368
‑
11453位中的T替换为U后得到的RNA分子。
[0016]所述RT序列为靶点序列3
’
端3个碱基及其后连续的一段基因组序列的反向互补序列，且在其中引入目标突变，作为反转录酶的反转录模板，反转录出cDNA，然后作为修复模板，对基因组DNA进行修复。所述RT序列大小进一步可为8
‑
34bp。
[0017]所述PBS序列(引物结合位点序列)为靶点序列5
’
端第n个碱基到第17个碱基靶点序列的反向互补序列(1≤n<17)。
[0018]所述RT序列和所述PBS序列的设计方法或原理可参照现有技术中已报道的有关于引导编辑技术(Prime editing，PE)中与pegRNA的RT序列和PBS序列相关的设计方法或原理。
[0019]所述RT序列可为RT
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S模板形式或RT
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M模板形式，优选RT
‑
M模板形式。所述RT
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S模板形式的RT序列中仅包含一个目标突变位点(即希望发生突变的位点)，且在目标突变位点引入突变碱基。所述RT
‑
M模板形式的RT序列除了在目标突变位点引入突变碱基外，还可能在目标突变位点以外的其它位点(记作额外突变位点)引入突变碱基，即RT序列中引入的突变碱基可以是在目标突变位点引入不少于两个突变碱基，也可以是在目标突变位点引入突变碱基的同时，在目标突变位点以外的其它位点引入额外的突变碱基。额外突变位点可为RT序列中除目标突变位点以外的任一位点。在实际应用中，可根据实际需要，选择合适的位点作为额外突变位点并引入合适的突变碱基，如仅期望目标突变位点的碱基发生突变后引起氨基酸序列的改变，而额外突变位点的碱基发生突变后不引起氨基酸序列的改变时，可通过设计对额外突变位点的碱基进行同义突变。进一步的，所述引入突变碱基的方式为碱基替换。更进一步的，在目标突变位点引入的突变碱基的数量可为一个或两个或多个。在本专利技术的实施例中，在目标突变位点引入的突变碱基的数量具体为一个。在目标突变位点以外的其它位点引入的额外的突变碱基的数量可为一个或两个或多个。
[0020]所述连接序列可为任意长度的连接序列。在本专利技术的具体实施例中，所述连接序列为大小为8bp的连接序列，并将其记作8
‑
bp linker，所述8
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bp linker可通过pegLIT(https://doi.org/10.1038/s41587
‑
021
‑
01039
‑
7)按照本
公知方法设计得到。在本专利技术的具体实施例中，所述8
‑
bp linker为aacgagag、taaatatt、aaagaaga、atataatc、actctctg、cgaagagg、aagataac、aagtctta、ttataaga、aaggaagg或aat本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.成套系统，所述成套系统包括融合蛋白、esgRNA和pegRNA；所述融合蛋白依次包括反转录酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白；所述esgRNA靶向MLH1基因靶点序列；所述pegRNA依次包括esgRNA
’
、逆转录模板序列、引物结合位点序列、连接序列和tevopreQ1基序；所述esgRNA
’
靶向目标基因靶点序列。2.根据权利要求1所述的成套系统，其特征在于：所述esgRNA由MLH1基因靶点序列和esgRNA骨架组成；或，所述esgRNA
’
由目标基因靶点序列和esgRNA骨架组成；或，所述pegRNA由复合型启动子驱动表达；所述复合启动子依次由E35S启动子、CmYLCV启动子和OsU3启动子组成；或，所述E35S启动子的核苷酸序列如序列7第10025
‑
10461位所示；或，所述CmYLCV启动子的核苷酸序列如序列7第10462
‑
10920位所示；或，所述OsU3启动子的核苷酸序列如序列7第10932
‑
11270位所示。3.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述Cas9切刻酶为Cas9maxn；或，所述Cas9maxn为A1)或A2)：A1)氨基酸序列是序列5所示的蛋白质；A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的成套系统，其特征在于：所述反转录酶为M
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MLV RT；或，所述M
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MLV RT为B1)或B2)：B1)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；B2)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。5.根据权利要求1
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4任一所述的成套系统，其特征在于：所述自切割寡肽为来源于病毒基因组的2A自切割寡肽；或，所述来源于病毒基因组的2A自切割寡肽为来源于猪捷申病毒
‑
1的2A自切割寡肽；或，所述来源于猪捷申病毒
‑
1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨进孝，徐雯，赵久然，杨永星，张璐，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：