一种胞外生物大分子的分离和检测方法技术

本发明专利技术提供一种胞外生物大分子的分离和检测方法，属于分子生物技术领域。所述方法包括采用荧光染料标记目标胞外生物大分子的步骤，采用磁捕获子和外加磁场分离胞外生物大分子的步骤，采用粒子分析检测设备进行单纳米颗粒分析，所述捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂。所述方法具有操作步骤少，准确性高，胞外生物大分子生物特征破坏少等优点，有临床应用的巨大潜力。有临床应用的巨大潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种胞外生物大分子的分离和检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种胞外生物大分子的分离和检测方法。

技术介绍

[0002]胞外生物大分子为细胞外的核酸、蛋白、碳水化合物或脂质或其组合。例如细胞外可作为肿瘤标志物的蛋白，例如血清肿瘤标志物蛋白，例如CEA、AFP、CA19
‑
9、SCC、NSE、CK19、CA125、CA 15
‑
3、CA 19
‑
9；例如细胞外具有临床诊断价值的核酸，例如细胞外具有临床诊断价值的脱氧核糖核酸；例如血浆循环肿瘤细胞释放的游离脱氧核糖核酸；例如细胞外具有质膜结构生物大分子，例如细胞外囊泡；例如细胞外有生命特质的核蛋白颗粒，例如体液中具有致病或者感染性的病原体，例如具有血液感染性的病毒，例如血液中艾滋病病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒。
[0003]近年来，随着人们对胞外生物大分子的研究和认识加深，胞外生物大分子检测作为一种新型的液体活检热点技术已被许多临床科研机构广泛地应用于肿瘤和疾病的无创诊断、治疗和监测；如何高效地提取胞外本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物液体中胞外生物大分子的分离和检测方法，其包括：采用荧光染料标记目标胞外生物大分子的步骤，采用磁捕获子与目标胞外生物大分子结合的步骤，采用外加磁场分离目标胞外生物大分子的步骤，采用洗脱液解除目标胞外生物大分子与磁捕获子的结合的步骤，以及采用粒子分析检测设备进行单纳米颗粒分析，所述捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂；所述磁捕获子包括固相载体、连接介质和捕获剂，或者所述磁捕获子包括固相载体和捕获剂。2.根据权利要求1所述的方法，其包括：步骤S1：所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构，使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合；步骤S2：所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂，使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合；步骤S3：通过外加磁场，将目标胞外生物大分子与生物液体分离；步骤S4：用洗脱液解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合，并除去固相载体；步骤S5：经过步骤S1、S2、S3和S4后，得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子，采用粒子分析检测设备对结合荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析；其中，所述步骤S1、步骤S2、步骤S3、步骤S4和步骤S5的顺序为：(1)步骤S1
→
步骤S2
→
步骤S3
→
步骤S4
→
步骤S5；或者(2)步骤S2
→
步骤S1
→
步骤S3
→
步骤S4
→
步骤S5；或者(3)步骤S1和步骤S2同时进行
→
步骤S3
→
步骤S4
→
步骤S5；或者(4)步骤S2
→
步骤S3
→
步骤S1
→
步骤S4
→
步骤S5。3.根据权利要求1
‑
2任一项所述的方法，其包括：选自以下任一方法：将荧光染料与生物液体混合，所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构，孵育，使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合；再加入磁捕获子，所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂，孵育，使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合；置外加磁场进行分离富集，去除上清液，洗涤，将目标胞外生物大分子与生物液体分离，得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子，用洗脱液洗脱解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合，并除去固相载体，得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子；采用粒子分析检测设备对包含荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析；或者其包括：将捕获子与生物液体混合，所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂，孵育，使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合；再加入荧光染料，所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构，孵育，使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合；置外加磁场进行分离富集，去除上清液，洗涤，将目标胞外生物大分子与生物液体分离，得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子，用洗脱液洗脱解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合，并除去固相载体，得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子；采用粒子分析检测设备对包含荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析；或者其包括：将磁捕获子和荧光染料与生物液体混合，所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂，所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结
构，孵育，使磁捕获子和荧光染料与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合；置外加磁场进行分离富集，去除上清液，洗涤，将目标胞外生物大分子与生物液体分离，得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子，用洗脱液洗脱解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合，并除去固相载体，得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子；采用粒子分析检测设备对包含荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析；或者其包括：将磁捕获子与生物液体混合，所述磁捕获子中的捕获剂为能与目标胞外生物大分子结合的捕获剂，孵育，使磁捕获子与目标胞外生物大分子通过捕获剂结合；置外加磁场进行分离富集，去除上清液，洗涤，将目标胞外生物大分子与生物液体分离；荧光染料与目标胞外生物大分子混合，所述荧光染料含能与目标胞外生物大分子结合的适配结构，孵育，使荧光染料与目标胞外生物大分子通过适配结构结合，得到结合荧光染料和磁捕获子的目标胞外生物大分子，通过离心、超滤或透析除去游离的荧光染料，用洗脱液解除磁捕获子与目标胞外生物大分子的结合，并除去固相载体，得到结合荧光染料的目标胞外生物大分子；采用粒子分析检测设备对结合荧光染料的目标胞外生物大分子进行单纳米颗粒分析。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，所述捕获剂包括选自多肽、蛋白质、抗体、配体和/或受体、酶、生长因子、糖脂类、多糖、核酸中的至少一种或其组合；和/或所述捕获剂为抗体、脂类、多糖中的至少一种或其组合。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的方法，所述抗体包括选自CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体、TIM4蛋白、Annexin V蛋白、细胞外囊泡蛋白特异抗体、疾病标志物蛋白特异抗体或病毒特异抗体中的至少一种或其组合；和/或所述疾病包括肿瘤、炎症、慢性病或神经退行性疾病；和/或所述脂类包括选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、1,2
‑
二
‑
O
‑
十八碳烯基
‑3‑
三甲基丙烷、1,2
‑
二油酰
‑3‑
三甲基
‑
丙烷、3β
‑
[N
‑
(N',二甲基氨基乙烷盐酸盐)
‑
氨基甲酰基]胆固醇、1,2
‑
二
‑
O
‑
十八碳烯基
‑3‑
二甲基的丙烷、1,2
‑
二油酰
‑3‑
二甲基
‑
丙烷、蛋磷脂酰胆碱、L
‑
α
‑
磷脂酰胆碱、胆固醇、1,2
‑
二棕榈酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱、饱和脂肪酸、1
‑
1,2
‑
二油酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱、1,2
‑
二硬脂酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸乙醇胺
‑
N
‑
[甲氧基(聚乙二醇)]中的至少一种或其组合；和/或所述多糖包括选自肝素、聚乳糖胺、α2,6结合唾液酸、高甘露糖聚糖、复合型N
‑
糖链中的至少一种或其组合；和/或所述核酸包括选自核酸适配体、核酸探针中的至少一种或其组合。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的方法，所述固相载体表面负载官能基团，所述官能基团包括选自羟基、羧基、氨基、醛基、环氧基、马来酰亚胺、对甲苯磺酰基、N
‑
羟基琥珀酰亚胺或巯基中的至少一种或其组合。7.根据权利要求1
‑
6任一项所述的方法，所述捕获剂通过直接连接或间接连接的方式与固相载体连接，或者所述捕获剂通过连接介质与固相载体连接，和/或所述捕获剂通过间接连接的方式与固相载体连接，固相载体表面的负载官能基团通过连接介质而实现捕获剂与固相载体的结合；和/或所述连接介质包括选自寡核苷酸单链、寡核苷酸双链、含特异限制性酶切位点的寡核苷酸双链，或者包含二硫键桥连分子的连接分子；和/或
所述包含二硫键桥连分子的的连接分子包括选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
二硫键(DSPE
‑
PEG
‑
SS)、生物素二硫键(NHS
‑
SS
‑
biotin)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS)、双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐(BS3)、酒石酸二琥珀酰亚胺(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo
‑
DST)、双(2
‑
(琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(BSOCOES)、双(2
‑
(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基)砜(sulfo
‑
BSOCOES)、乙二醇
‑
双(琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(EGS)、乙二醇
‑
双(磺基琥珀酰亚胺酯丁二酸酯)(sulfo
‑
EGS)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、N,N'
‑
二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二甲基己二亚酰胺酯(DMA)、庚二酰亚胺酸二甲酯(DMP)、二甲基辛二硝酸酯(DMS)、3,3'
‑
二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4
‑
二(3'
‑
(2'
‑
二硫基吡啶)丙酸酰氨基)丁烷(DPDPB)、二马来酰亚胺基己烷(BMH)、二氟二硝基苯(DFDNB)、二氟二硝基苯基砜(DFDNPS)、二硫化二(β
‑
(4
‑
叠氮水杨酰氨基)乙基)(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4
‑
丁二醇缩水甘油醚、已二酸二酰肼(ADH)、碳酰肼、二氨二甲基联苯、对二氨基联苯、氮
‑
琥珀星氩氨
‑
3(2
‑
吡啶二硫代)
‑
酸酯(SPDP)、长链
‑
氮
‑
琥珀星氩氨
‑
3(2
‑
吡啶二硫代)
‑
酸酯(LC
‑
SPDP)、磺基长链
‑
氮
‑
琥珀星氩氨
‑
3(2
‑
吡啶二硫代)
‑
酸酯(sulfo
‑
LC
‑
SPDP)、琥珀酰亚胺基氧代羰基
‑
甲基
‑
(2
‑
吡啶基硫代)苯(SMPT)、磺基长链
‑
琥珀酰亚胺基氧代羰基
‑
甲基
‑
(2
‑
吡啶基硫代)苯(sulfo
‑
LC
‑
SMPT)、4
‑
(N
‑
马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N
‑
羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4
‑
(N
‑
马来酰亚胺基甲基)环己烷
‑1‑
羧酸3
‑
硫代
‑
N
‑
琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo
‑
SMCC)、马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)、M
‑
马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯(sulfo
‑
MBS)、N
‑
琥珀酰亚胺(4
‑
碘代乙酰基)氨基苯甲酸(SIAB)、磺基
‑
N
‑
琥珀酰亚胺(4
‑
碘代乙酰基)氨基苯甲酸(sulfo
‑
SIAB)、4
‑
(4
‑
马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺基
‑4‑
(P
‑
马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sulfo
‑
SMPB)、4
‑
马来酰亚胺基丁酸
‑
N
‑
琥珀酰亚胺酯(GMBS)、磺基马来酰亚胺基丁酸
‑
N
‑
琥珀酰亚胺酯(sulfo
‑
GMBS)、琥珀酰亚胺基
‑6‑
((碘乙酰基)氨基)己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺基
‑6‑
(6
‑
(((4
‑
碘代乙酰基)氨基)己酰)氨基)己酸(SIAXX)、琥珀酰亚胺基
‑4‑
(((碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷
‑1‑
羧酸(SIAC)、琥珀酰亚胺基
‑6‑
((((4(碘代乙酰基)氨基)甲基)环己烷
‑
为
‑1‑
羰基)氨基)己酸(SIACX)、4
‑
硝基苯酯碘乙酸(NPIA)、4
‑
(4
‑
N
‑
马来酰亚胺苯甲胺酯)丁酸酰肼(MPBH)、4
‑
N
‑
马来酰亚胺甲基环己烷
‑1‑
羧基酰肼(M2C2H)、3
‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丙酰酰肼(PDPH)、N
‑
羟基琥珀酰亚胺
‑4‑
叠氮基水杨酸(NHS
‑
ASA)、N
‑
羟基磺基琥珀酰亚胺
‑4‑
叠氮基水杨酸(sulfo
‑
NHS
‑
ASA)、磺基琥珀酰亚胺
‑4‑
叠氮水杨基氨基己酸(sulfo
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱少彬，田野，马玲，袁心悦，
申请(专利权)人：厦门福流生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：