【技术实现步骤摘要】
一种病毒核酸载体的单颗粒分析方法
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种病毒核酸载体的单颗粒分析方法
。
技术介绍
[0002]病毒核酸载体为一类通过遗传操作对自身的元件进行改造后能够携带外源基因的病毒载体，其中最具由于代表性的病毒核酸载体有四种：慢病毒载体
、
逆转录病毒载体
、
单纯疱疹病毒载体
、
重组冠状病毒载体
。
以上载体具有载大片段外源性目的基因
、
稳定并持续表达目标核酸
、
免疫反应小等优点，因而成为目前应用最广泛的基因治疗的运载工具之一，已经证明该类产品取得了明确的临床疗效
。
单纯疱疹病毒载体作为重要的溶瘤病毒产品，国内已经于
2009
年批准第一款溶瘤
HSV
‑
1(orienX010)
病毒开展临床试验；于
2018
年批准了溶瘤
HSV
‑
2(rHSV2hGM
‑
【技术保护点】
【技术特征摘要】 【专利技术属性】
1.
一种病毒核酸载体的一种或多种指标的检测方法，其包括：步骤
(1)
：制备针对病毒核酸载体指标中各参数的光学试剂，并将所述光学试剂与含病毒核酸载体的样品混合，使所述光学试剂与病毒核酸载体特异性结合；所述光学试剂包括核酸探针或核酸染料试剂，和选自脂膜染料试剂
、
或缀合荧光染料的特异性抗靶标试剂中的至少一种，所述参数包括病毒外壳蛋白标志物表达信号和
/
或病毒囊膜标志物表达信号以及核酸信号或目标核酸信号；优选地，所述参数包括核酸信号或目标核酸信号，和囊膜蛋白标志物表达信号；步骤
(2)
：采用流式颗粒检测设备检测含病毒核酸载体的样品溶液，记录含病毒核酸载体的样品的散射光通道检测数据和
/
或荧光通道检测数据；和步骤
(3)
：数据分析，计算各指标结果；其中，所述病毒核酸载体包括慢病毒载体
、
逆转录病毒载体
、
单纯疱疹病毒载体
、
重组冠状病毒载体；和
/
或所述指标包括病毒核酸载体的生物功能性滴度；所述病毒核酸载体的生物功能性滴度包括：含有核酸
、
病毒外壳和囊膜的病毒核酸载体的滴度
、
含有核酸和囊膜的病毒核酸载体的滴度
、
含有核酸和病毒外壳的病毒核酸载体的滴度
、
含有目标核酸
、
病毒外壳和囊膜的病毒核酸载体的滴度
、
含有目标核酸和囊膜的病毒核酸载体的滴度
、
含有目标核酸和病毒外壳的病毒核酸载体的滴度
、
空壳体病毒核酸载体的滴度；和
/
或所述指标包括慢病毒载体的生物功能性滴度，所述慢病毒载体的生物功能性滴度包括：含有核酸
、
慢病毒外壳和囊膜的慢病毒载体的滴度
、
含有目标核酸
、
慢病毒外壳和囊膜的慢病毒载体的滴度
、
核酸和
VSV
‑
G
的慢病毒载体的滴度
、
含有目标核酸和
VSV
‑
G
的慢病毒载体的滴度
、
含有核酸和囊膜的慢病毒载体的滴度
、
含有目标核酸和囊膜的慢病毒载体的滴度
、
空壳体慢病毒载体的滴度
、
含有核酸的缺失
VSV
‑
G
的慢病毒载体的滴度
、
含目标核酸的缺失
VSV
‑
G
的慢病毒载体的滴度
、
含有核酸的缺失囊膜的慢病毒载体的滴度
、
含有目标核酸的缺失囊膜的慢病毒载体的滴度
、
含有核酸和慢病毒外壳的慢病毒载体的滴度
、
含有目标核酸和慢病毒外壳的慢病毒载体的滴度
、
含有核酸的缺失慢病毒外壳的慢病毒载体的滴度
、
含有目标核酸的缺失慢病毒外壳的慢病毒载体的滴度
、
含有核酸和
p24
蛋白的慢病毒载体的滴度
、
含有目标核酸和
p24
蛋白的慢病毒载体的滴度
、
含有核酸的缺失
p24
蛋白的慢病毒载体的滴度
、
含有目标核酸的缺失
p24
蛋白的慢病毒载体的滴度
、
含有核酸和囊膜的缺失慢病毒外壳的慢病毒载体的滴度
、
含有目标核酸和囊膜的缺失慢病毒外壳的慢病毒载体的滴度
、
含有核酸和慢病毒外壳的缺失囊膜的慢病毒载体的滴度
、
含有目标核酸和慢病毒外壳的缺失囊膜的慢病毒载体的滴度
、
含有核酸的缺失慢病毒外壳和囊膜的慢病毒载体的滴度
、
或者含有目标核酸的缺失慢病毒外壳和囊膜的慢病毒载体的滴度；和
/
或所述指标包括逆转录病毒载体的生物功能性滴度，所述逆转录病毒载体的生物功能性滴度包括：含有核酸
、gag
外壳蛋白和
env
囊膜蛋白的逆转录病毒载体的滴度
、
含有目标核酸
、gag
外壳蛋白和
env
囊膜蛋白的逆转录病毒载体的滴度
、
核酸和
env
囊膜蛋白的逆转录病毒的滴度
、
含有目标核酸和
env
囊膜蛋白的逆转录病毒载体的滴度
、
空壳逆转录病毒载体的滴度
、
含有核酸的缺失
env
囊膜蛋白的逆转录病毒载体的滴度
、
含目标核酸的缺失
env
囊膜蛋白的逆转录病毒载体的滴度
、
含有核酸和
gag
外壳蛋白的逆转录病毒载体的滴度
、
含有目标核酸和
gag
外壳蛋白的逆转录病毒载体的滴度
、
含有核酸的缺失
gag
外壳蛋白的逆转录病
毒载体的滴度
、
含有目标核酸的缺失
gag
外壳蛋白的逆转录病毒载体；和
/
或所述指标包括单纯疱疹病毒载体的生物功能性滴度，所述单纯疱疹病毒载体的生物功能性滴度包括：含有核酸和
g
囊膜糖蛋白的单纯疱疹病毒载体的滴度
、
含有目标核酸和
g
囊膜糖蛋白的单纯疱疹病毒载体的滴度
、
空壳单纯疱疹病毒载体的滴度
、
含有核酸的缺失
g
囊膜糖蛋白的单纯疱疹病毒载体的滴度
、
含目标核酸的缺失
g
囊膜糖蛋白的单纯疱疹病毒载体的滴度；和
/
或所述
g
囊膜糖蛋白包括囊膜糖蛋白
gB,
囊膜糖蛋白
gC,
囊膜糖蛋白
gD,
囊膜糖蛋白
gE,
囊膜糖蛋白
gG,
囊膜糖蛋白
gH,
囊膜糖蛋白
gI,
囊膜糖蛋白
gJ,
囊膜糖蛋白
gL,
囊膜糖蛋白
gM,
囊膜糖蛋白
gN
中任一种或其组合；和
/
或所述指标包括重组冠状病毒载体的生物功能性滴度，所述重组冠状病毒载体的生物功能性滴度包括：含有核酸和
SPIKE
蛋白的重组冠状病毒载体的滴度
、
含有目标核酸和
SPIKE
蛋白的重组冠状病毒载体的滴度
、
空壳重组冠状病毒载体的滴度
、
含有核酸的缺失
SPIKE
蛋白的重组冠状病毒载体的滴度
、
含目标核酸的缺失
SPIKE
蛋白的重组冠状病毒载体的滴度
。2.
根据权利要求1所述的检测方法，其还包括以下步骤：步骤
(a)
：在步骤
(2)
前，制备浓度标准溶液，采用流式颗粒检测设备检测所述浓度标准溶液，记录浓度标准溶液的散射光通道和
/
或荧光通道检测数据和
/
或流式颗粒检测设备的进样流速，对所述含病毒核酸载体的样品颗粒计数浓度进行测量；和
/
或步骤
(b)
：在步骤
(2)
前，制备不同粒径的粒径标准品的粒径标准溶液，采用流式颗粒检测设备检测所述粒径标准溶液，记录粒径标准溶液的散射光通道检测数据，对所述病毒核酸载体的粒径大小和粒度分布进行测量
。3.
根据权利要求1‑2任一项所述的方法，所述步骤
(1)
中所述将所述光学试剂与含病毒核酸载体的样品混合的操作中还包括加入表面活性剂与含病毒核酸载体的样品混合；任选地，所述表面活性包括阴离子表面活性剂
、
非离子表面活性剂
、
两性表面活性剂和阳离子表面活性剂中的至少一种；任选地，所述表面活性剂包括选自吐温型表面活性剂
、
曲拉通
X
‑
100、
十二烷基硫酸钠
、
壬基酚聚氧乙烯醚或聚氧乙烯型非离子表面活性中的至少一种
。4.
根据权利要求2‑3任一项所述的方法，所述步骤
(a)
包括：准备绝对数量已知的珠粒作为浓度标准品，制备浓度标准溶液；和
/
或所述步骤
(b)
包括：准备与病毒组合物相同或相近的折射率的珠粒类型作为粒径标准品，并应用电镜表征此粒径标准品的粒径中位值作为粒径标准品的准确粒径，制备含不同粒径的粒径标准品的粒径标准溶液
。5.
根据权利要求1‑4任一项所述的方法，所述抗靶标试剂包括选自抗体
、
抗体片段
、
抗体类似物
、
凝集素
、
适体
、
肽
、
生长因子
、
糖脂类
、
多糖
、
配体或受体中的至少一种，和
/
或所述抗靶标试剂为抗体，抗体片段或抗体类似物
、
配体或受体；和
/
或所述抗体包括选自
VSV
‑
G
抗体
、gB
抗体
、gC
抗体
、gD
抗体
、gE
抗体
、gG
抗体
、gH
抗体
、gI
抗体
、gJ
抗体
、gL
抗体
、gM
抗体
、gN
抗体
、env
抗体
、SPIKE
抗体
、
能与慢病毒外壳表达蛋白特异性结合的抗体
、
能与逆转录病毒外壳表达蛋白特异性结合的抗体
、
能与单纯疱疹病毒外壳表达蛋白特异性结合的抗体和能与重组冠状病毒外壳表达蛋白特异性结合的抗体中的至少一种；和
/
或
所述能与慢病毒外壳表达蛋白特异性结合的抗体包括选自
p24
抗体；和
/
或所述能与逆转录病毒外壳表达蛋白特异性结合的抗体包括选自
gag
抗体；和
/
或所述核酸探针包含与目标核酸或目标核酸的碱基互补的序列，且序列的5端或3端或中间修饰有荧光染料；和
/
或所述核酸染料试剂包含选择菁类染料
、
非渗透性染料
、
渗透性染料
、
嵌入型染料
、DNA
双螺旋小沟结合染料；和
/
或所述脂膜染料试剂包含选自能够亲合细胞膜和其它脂溶性膜结构亲脂性的荧光染料；和
/
或所述荧光染料包括荧光分子
、
荧光材料或其组合物，和
/
或所述荧光染料包括有机荧光分子
、
荧光蛋白
、
核酸染料
、
脂膜染料
、
量子点
、Polymer Dots
中的至少一种；和
/
或所述脂膜染料试剂或所述荧光染料中的脂膜染料分别独立选自
DiD
染料
、DiO
染料
、DiI
染料
、DiR
染料
、DiA
染料
、Di
‑8‑
Anepps
染料
、Di
‑4‑
ANEPPS
染料
、PHK26
染料
、PKH67
染料
、CellMask Green
染料
、CellMask Orange
染料
、CellMask Red
染料
、CellVue Lavender
染料
,CellVue Plum
染料
、CellVueNIR780
染料至少一种；和
/
或所述核酸染料试剂或所述荧光染料中的核酸染料分别独立包括选自
Acridine Orange、Actinomycin D、7
‑
AAD(7
‑
氨基放线菌素
D)、ACMA(9
‑
Amino
‑6‑
Chloro
‑2‑
Methoxyacridine)、BOBO
‑
1Iodid、BOBO
‑
3Iodide、DAPI(4',6
‑
Diamidino
‑2‑
Phenylindole,Dihydrochloride)、
二氢乙啶
(
氢乙啶
)、EthidiumHomodimer
‑
1(EthD
‑
1)、Ethidium Homodimer
‑
2(EthD
‑
2)、Ethidium Monoazide Bromide(EMA)、Hexidium Iodide、Hoechst 33258,Pentahydrate(bis
‑
Benzimide)、Hoechst 33342,Trihydrochloride,Trihydrate、Trihydrate
‑
FluoroPure Grade、Hoechst 34580、LDS 751、NeuroTrace Blue FluorescentNissl Stain、NeuroTrace Green Fluorescent Nissl Stain、NeuroTrace 530/615Red Fluorescent NisslStain、NeuroTrace Deep
‑
Red Fluorescent Nissl Stain、POPO
‑
1Iodide、POPO
‑
3Iodide、PO
‑
PRO
‑
1Iodide、
碘化丙啶
、Propidium Iodide、OliGreen、PicoGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBR GreenI、SYBR Green II、SYBR Safe DNA
凝胶染料
、SYTO 40、SYTO 41、SYTO 42、SYTO 45、SYTO 9、SYTO 11、SYTO 12、SYTO 13、SYTO 14、SYTO 16、SYTO 21、SYTO 24、SYTO BC Green、SYTO82、SYTO 83、SYTO 84、SYTO 85、SYTO 17、SYTO 59、SYTO 60、SYTO 61、SYTO 62、SYTO63、SYTO 64、SYTO RNASelect、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TO
‑
PRO
‑
1Iodide、TO
‑
PRO
‑
3Iodide、TOTO
‑
1Iodide、TOTO
‑
3Iodide、YO
‑
PRO
‑
1Iodid、YO
‑
PRO
‑
3Iodide、YOYO
‑
1Iodide、YOYO
‑
3Iodide、HCS NuclearMask Deep Red Stain、HCS NuclearMask BlueStain、HCS NuclearMask Red Stain、
溴化乙锭中的至少一种；和
/
或所述抗靶标试剂为抗体，所述抗体包括
VSV
‑
G
的抗体
、env
囊膜蛋白的抗体
、g
囊膜糖蛋白的抗体
、SPIKE
蛋白的抗体
、gag
的抗体
、p24
的抗体或病毒衣壳蛋白的抗体或者囊膜表达蛋白的抗体中的至少一种；和
/
或所述抗靶标试剂为配体和
/
或受体，所述配体和
/
或受体为
VSV
‑
G
的配体和
/
或受体
、env
囊膜蛋白的配体和
/
或受体
、g
囊膜糖蛋白的配体和
/
或受体
、SPIKE
蛋白的配体和
/
或受体
、gag
的配体和
/
或受体
、p24
的配体和
/
或受体
、
病毒衣壳蛋白的配体和
/
或受体或者囊膜表达蛋白的配体和
/
或受体中的至少一种；和
/
或
所述荧光染料包括荧光分子
、
荧光材料或其组合物，所述荧光染料与所述抗靶标试剂直接缀合；或所述荧光染料借助识别基团与所述抗靶标试剂间接缀合，所述识别基团包括抗体
、
抗原
、
受体或多糖，或任意其它的颗粒或分子，或其任意部分，所述识别基团能够特异地识别所述抗靶标试剂；和
/
或所述步骤
(1)
中的将所述光学试剂与含病毒核酸载体的样品混合包括将所述光学试剂和表面活性剂与含病毒核酸载体的样品混合；和
/
或所述步骤
(2)
包括采用流式颗粒检测设备对样品进行拍摄
、
计数和信号强度值测量具有特定光学特征的颗粒；和
/
或所述步骤
(2)
包括采用带有散射光通道和至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备或者带有至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备进行检测，一种荧光通道用于表征核酸或目标核酸信号，另一种荧光通道用于表征病毒囊膜标志物表达信号，分析具有事件阳性信号的颗粒群的荧光通道检测结果，记录检测结果散点图，并将所得结果散点图设门，其中，具有事件阳性信号
、
核酸阳性信号和病毒囊膜标志物表达阳性信号的颗粒群为含有核酸和囊膜的病毒核酸载体的颗粒，或者具有事件阳性信号
、
目标核酸阳性信号和病毒囊膜标志物表达阳性信号的颗粒群为含目标核酸和囊膜的病毒核酸载体的颗粒；具有事件阳性信号
、
病毒囊膜标志物表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳体病毒核酸载体的颗粒；具有事件阳性信号
、
核酸阳性信号和病毒囊膜标志物表达阴性信号为含有核酸的缺失囊膜的病毒核酸载体的颗粒，或者具有事件阳性信号
、
目标核酸阳性信号和病毒囊膜标志物表达阴性信号的颗粒群为含目标核酸的缺失囊膜的病毒核酸载体的颗粒；和
/
或所述病毒核酸载体为慢病毒载体，所述步骤
(2)
包括采用带有散射光通道和至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备或者带有至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备进行检测，一种荧光通道用于表征核酸或目标核酸信号，另一种荧光通道用于表征病毒囊膜标志物表达信号，分析具有事件阳性信号的颗粒群的荧光通道检测结果，记录检测结果散点图，并将所得结果散点图设门，其中，具有事件阳性信号
、
核酸阳性信号和
VSV
‑
G
表达阳性信号的颗粒群为含有核酸和
VSV
‑
G
的慢病毒载体的颗粒，或者具有事件阳性信号
、
目标核酸阳性信号和
VSV
‑
G
表达阳性信号的颗粒群为含有目标核酸和
VSV
‑
G
的慢病毒载体的颗粒；具有事件阳性信号
、VSV
‑
G
表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳体慢病毒载体的颗粒；具有事件阳性信号
、
核酸阳性信号和
VSV
‑
G
表达阴性信号为含有核酸的缺失
VSV
‑
G
的慢病毒载体的颗粒，或者具有事件阳性信号
、
目标核酸阳性信号和
VSV
‑
G
表达阴性信号的颗粒群为含目标核酸的缺失
VSV
‑
G
的慢病毒载体的颗粒；和
/
或所述病毒核酸载体为逆转录病毒载体，所述步骤
(2)
包括采用带有散射光通道和至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备或者带有至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备进行检测，一种荧光通道用于表征核酸或目标核酸信号，另一种荧光通道用于表征病毒囊膜标志物表达信号，分析具有事件阳性信号的颗粒群的荧光通道检测结果，记录检测结果散点
图，并将所得结果散点图设门，其中，具有事件阳性信号
、
核酸阳性信号和
env
囊膜蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有核酸和
env
囊膜蛋白的逆转录病毒载体的颗粒，或者具有事件阳性信号
、
目标核酸阳性信号和
env
囊膜蛋白表达信号的颗粒群为含有目标核酸和
env
技术研发人员：朱少彬，田野，马玲，吴圣福，
申请(专利权)人：厦门福流生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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