乳腺癌早期筛查的多重基因甲基化检测荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物基因工程技术领域，涉及一种乳腺癌早期筛查的多重基因甲基化检测荧光定量PCR试剂盒。本发明专利技术提出人外周血单个核细胞DNA中KLRK1、KLRD1、PLXNA4、TRDJ3基因在乳腺癌早期筛查试剂盒中的应用。本发明专利技术检测只需抽取患者2

【技术实现步骤摘要】
乳腺癌早期筛查的多重基因甲基化检测荧光定量PCR试剂盒


[0001]本专利技术属于生物基因工程
，涉及一种乳腺癌早期筛查的多重基因甲基化检测荧光定量PCR试剂盒。

技术介绍

[0002]乳腺癌是女性最常见的癌症，也是导致女性癌症死亡的主要原因之一。据2020年全球癌症统计数据显示，乳腺癌已超过肺癌，成为世界上发病率最高的恶性肿瘤，估计每年约有230万新发病例和68.5万死亡病例，对人类健康构成严重威胁。早期诊断是降低癌症死亡率的关键，降低的程度从15%到25%不等。但现有的诊断方法，如钼靶和B超因其假阳性率较高，诊断准确性主要于检查设备和检查医生的个人经验，主观性强，容易导致过度诊断和过度治疗。因此，迫切需要开发一种灵敏度高、特异性强的乳腺癌早期诊断方法，以提高乳腺癌的诊治和预后水平。
[0003]DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，是指在DNA甲基转移酶的催化下，以S
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腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。它可以在不改变DNA序列的情况下控制基因表达，在许多生物学过程中发挥重要作用，包括癌症的发生和发展。既往研究表明，在许多癌症发生早期，DNA 甲基化水平即出现微量变化。因此准确并且定量检测DNA甲基化标志物对于癌症的早期诊断具有十分重要的意义。
[0004]以往关于DNA甲基化作为癌症生物标志物潜力的研究主要集中在肿瘤组织和源自肿瘤的生物材料的使用，包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA(cfDNA)、细胞游离DNA和肿瘤宿主微环境。然而，肿瘤组织不易获取且有创，血清或血浆中cfDNA含量低，碎裂程度高，循环肿瘤细胞容易与正常细胞混合，特异性低，限制了其临床应用。最近的研究表明，外周血单个核细胞（PBMC）中存在癌症特异性DNA甲基化差异，这些差异已在多种癌症中得到证实，如肝细胞癌、前列腺癌、结直肠癌和头颈部鳞状细胞癌，已经发现慢性肝炎和肝癌患者外周血单个核细胞DNA甲基化谱存在显著差异，反映了肿瘤发生过程中宿主免疫系统的表观遗传重编程。但是针对乳腺癌与健康对照者外周血单个核细胞DNA甲基化的差异研究较少，目前还未报道与乳腺癌发病风险相关的高特异性、高灵敏度DNA甲基化标志物。
[0005]单基因甲基化检测存在种族差异和早期癌变阶段检出明显不足的缺陷，多基因甲基化联合检测可能弥补这些不足。荧光定量方法由于其方法的简便性，以及荧光定量PCR仪器的普及，在检测基因甲基化上发挥着重要作用。荧光探针定量PCR检测技术融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，是目前临床检验中认同程度很高的一种检测技术，己广泛应用于科学研究和临床检测。但目前该技术平台上还没有能够快速、简便、特异性的检测乳腺癌多基因甲基化的技术性产品。因此，开发一种基于乳腺癌外周血单个核细胞DNA的多基因甲基化检测方法具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对传统乳腺癌早期诊断假阳性高，乳腺癌血液早期筛查缺乏特异性标志
物等技术问题，提供一种用于乳腺癌早期筛查的人外周血单个核细胞DNA中KLRD1、KLRK1、PLXNA4、TRDJ3基因甲基化联合检测荧光定量PCR试剂盒及其应用，KLRD1基因序列为AAAATGAAAATTGAGGTGTTGAAAAAAGCTTTTAAGGCTAACGTGAATGAGGCGTCCAAGTGGGAAACCCATCCAGTTCTACTTTTTTGAACTTTGCCTGTCGTGGCCAGGATAATTAGGTAGAGATCAGAAGAACAGAGTGAGACATGGAAATCCCAATTTATGTGACCTTGGGCAAATTACTTAGCTCTGTATGCCTCAGT；KLRK1基因序列为TATATTTTTTAATCTATGCACATGACTTTTTCTTGTCTGTATTTTTACCCTTCTCAATTTGTCTATCTATGCCCCACATGCCACTTTGCCTTTATTAATACGGTTTTAACATAGGTCTTACTATCTAGTAAAACAAGGCTCCCACATTTTCTTCATCTTCAATTGTGACTTTCCTAGTCTTGACTTTTGTAATTTAATGTACA；PLXNA4基因序列为：GTCCAGGAGCTAGACCGAGCTATCCGTGGGCTGCTCTCAAAATTACTTTTTATTTTGCTTGAAAGGCATGAGTCCCAATCATTTGCAACCTTGTCTTTGACGACCGTAATTTCACTCCTTTAGTGCACACGTCACATGAAGCGGGGGGAAAGGAGGTGAGGAAAGTGCCAATTTAGATGTCTTTGATGTTTTCTGATGTGTGT；TRDJ3基因的序列为：GGATGTGAAAATTTTCAAATCAAACCCCAAGTCCTTAAAGCTTTGACAGTGAATAATGGCCCTACACAACTGTCATTCTCTTTTGCCTGGCTCTAGCCCAACGATCTTGATTTTTGGTGATGAGGCAGAGTAATTCACATGGTCTTTATGTTACATTGCACATGATGACTATATACTCCTGAAACTTATATCTGGATCCAGAG。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术是采用下述的技术方案实现的：本专利技术提出人外周血单个核细胞DNA中KLRK1、KLRD1、PLXNA4、TRDJ3基因在乳腺癌早期筛查试剂盒中的应用，确切来讲，是KLRK1、KLRD1、PLXNA4、TRDJ3基因甲基化联合检测荧光定量PCR试剂盒中的应用。KLRK1、KLRD1、PLXNA4、TRDJ3基因目的位点为KLRK1、KLRD1、PLXNA4、TRDJ3基因转录起始位点上下游1500bp的区间或基因体中的一个CpG位点；所述内参基因为β
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actin；所述试剂盒包括PCR扩增反应体系。试剂盒所检测的靶区域选自KLRK1基因的DNA甲基化位点chr12：10390473
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10390475、KLRD1基因的DNA甲基化位点chr12：10307372
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10307374、PLXNA4基因的DNA甲基化位点chr7:132485892
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132485894及TRDJ3基因的DNA甲基化位点chr14：22458271
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22458273。
[0008]一种用于乳腺癌早期筛查的无创多基因甲基化联合检测荧光定量PCR试剂盒，其包括用于检测KLRK1、KLRD1、PLXNA4、TRDJ3基因甲基化的引物对和探针，其中各引物及探针的核苷酸序列如下表所示：表1引物及探针的核苷酸序列
作为优选，所述KLRK1、KLRD1、PLXNA4、TRDJ3基因特异的水解探针5 '端报告荧光基团为FAM，3 '端的猝灭基团为BHQ1；所述内参基因的水解探针5 '端报告荧光基团为VIC，3 '端的猝灭基团为BHQ1。
[0009]作为优选，所述试剂盒中还包括阴性质控品、阳性质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人外周血单个核细胞DNA中KLRK1、KLRD1、PLXNA4、TRDJ3基因在早期乳腺癌诊断试剂盒中的应用。2.一种用于乳腺癌早期筛查的无创多基因甲基化联合检测荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括用于检测KLRK1、KLRD1、PLXNA4、TRDJ3基因甲基化的引物对和基因特异的水解探针；用于检测KLRK1基因目的位点的甲基化特异引物对为：正向GTTATGATTAGGAAAGTTATAATTGAAGATG、反向CACTTACCACTTTACCTTTATTAATACGA，KLRK1基因特异的水解探针序列为ACATAAATCTTACTATCTAATAAAACAAAACTCCCACA；用于检测KLRD1基因目的位点的甲基化特异引物对为：正向TATCTAATTATCCTAACCACGACAAAC、反向CTATTCTCTACCTAATTATCCTAACCACG，KLRD1基因特异的水解探针序列为AATAAATCTAAATAAATTTCCCACTTAAACGCC；用于检测PLXNA4基因目的位点的甲基化特异引物对为：正向TTTTAAAGTTTATTATAGGAAGAGGTTGTT、反向CAATCATTTACAACCTTATCTTTAACG，PLXNA4基因特异的水解探针基因为CACTCCTTTAATACACACGTCACATAAAACG；用于检测TRDJ3基因目的位点的甲基化特异引物对为：正向GATGTGTAGTTTAGGTAGGGGATGT、反向TACCTCATCACCATAAATCAAAATCG，TRDJ3基因特异的水解探针基因为CTAAAACCAAACAAAAAAAATAACAATTATATAAAACC。3.根据权利要求2所述用于乳腺癌早期筛查的无创多基因甲基化联合检测荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，还包括内参基因ACTB的引物对和探针，其中内参ACTB的引物对为正向TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT、反向AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAAA ，探针序列为ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA。4.根据权利要求3所述用于乳腺癌早期筛查的无创多基因甲基化联合检测荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，KLRK1、KLRD1、PLXNA4、T...

【专利技术属性】
技术研发人员：王传新，杜鲁涛，李培龙，李娟，王恬恬，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：