一种寡霉素A的提纯方法技术

本发明专利技术涉及一种寡霉素的提纯方法，使用有机溶剂浸泡湿菌渣后用过滤得到浸提液，C18反相制备层析得到层析液，并经过精制得到目标产品。本发明专利技术的提纯工艺步骤少、操作简单，使用溶剂种类少，成本低，适合工业化生产。本方法同时避免了使用硅胶层析和氯仿等不易处理或有毒害的物质。采用本发明专利技术提供的方法提纯的寡霉素A纯度可稳定达到98％以上。A纯度可稳定达到98％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种寡霉素A的提纯方法


[0001]本专利技术属于生物制药领域，涉及寡霉素A的提取和纯化，特别涉及一种在发酵培养后提取并纯化寡霉素的方法。

技术介绍

[0002]寡霉素A，来源于淀粉酶产色链霉菌，其结构式如下。寡霉素A是ATP合成酶的抑制剂，抑制氧化磷酸化和所有发生在线粒体耦合膜的ATP依赖性过程。寡霉素A通过阻断其质子通道(Fo亚基)抑制ATP合成，进而影响ADP通过氧化磷酸化转化为ATP。
[0003][0004]CN101368166A记载了一种寡霉素A菌株及其生产方法，其中涉及提取部分为获得菌渣后，使用丙酮或乙酸乙酯浸提，减压蒸馏除去有机溶剂，然后在水相沉淀或通过正己烷
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乙醇体系进行萃取、蒸馏拿到粗品，最后用正己烷
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乙醇体系进行高压制备，再用相同的体系进行沉淀，最后烘干。该技术方案的特点是步骤较长，涉及大量的有机溶剂。
[0005]Masamune.S等人于1960年发表的《Separation and Preliminary Characterization of Oligomycins A,B and C1》文献首次提及了寡霉素系列化合物的分离纯化方法。在发酵后，大量水相萃取，然后用缓慢地过一根大体积的硅藻土柱，用二氧六环洗涤，收集后浓缩，结晶，得到寡霉素A(66.8％)、寡霉素B、寡霉素C的混合物，然后用薄层色谱分析法分离并浓缩得到寡霉素A。该方法的特点是寡霉素纯度不高且不适用于工业化。
[0006]P.W.Yang等人于2010发表的《Oligomycins A and C,major secondary metabolites isolated from the newly isolated strain Streptomyces diastaticu》文献中记载了一种寡霉素A的提取方法，菌渣过滤后，用丙酮浸提，用200
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400目硅胶、氯仿醇系统进行正相层析、再用Sephadex LH
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20层析、C18(20
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45um)层析、热甲醇中结晶。该方法使用过多次的层析工艺，成本高且使用了毒性较大的氯仿。
[0007]2008年植物保护学报中的一篇文章《藤黄灰链霉菌ECO 00001菌株中寡霉素A和C的分离鉴定及其活性》也描述到了寡霉素A的提取纯化方法，将发酵液离心分离后，用丙酮浸提，浓缩，然后用氯仿甲醇体系硅胶柱层析，收集合格组分后薄层层析，浓缩，用Sephadex LH
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20凝胶层析，甲醇重结晶。该方法的缺陷主要是层析过多，成本过高，且同样使用了氯仿。
[0008]上述的分离提纯的步骤均较为复杂，不适于工业化生产，通常会使用到环境不友好的试剂和步骤，固废和液废量大，且分离得到目标物纯度不高或者收率低。我们需要开发目标物收率高，纯度高并且成本低适合工业化生产的工艺。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供一种操作简单、适合工业化、溶剂单一且安全便宜(主要是甲醇)、产品纯度高的寡霉素A的提纯方法。具体来说，本专利技术所记载的方法只需要浸提、一次制备、打浆就可以拿到成品，且可以获取纯度稳定在98％以上的产物。
[0010]本专利技术提供一种高产的寡霉素A的提取和纯化方法，具体通过使用寡霉素A的发酵液，经过滤布过滤，C18制备和精制得到目标产品。
[0011]本专利技术涉及的寡霉素A可以是发酵合成的，也可以是天然存在的寡霉素A。本专利技术涉及的寡霉素A发酵液为通过常规发酵技术获取的，可以是寡霉素A发酵液，也可以是寡霉素A的水溶液，也可以是经过过滤得到的寡霉素A滤液，也可以是经过离心得到的寡霉素A上清液。
[0012]针对现有技术提纯技术中使用正相填料的大部分为混合溶剂，其环境毒性大，回收套用困难，分离得到目标物纯度不高或者收率低的现状，本专利技术使用反相填料进行高压制备层析，并在填料中选取C18填料及制备方法，使得本专利技术的提纯方法简单快捷、分离效果好，纯度高，操作安全，填料可回收使用。
[0013]本专利技术使用甲醇作为纯化环节的单一溶剂，这种单一试剂的选择确保引入杂质的可能性最小化，且成本低。
[0014]使用本专利技术提供的方法来提取纯化获得的寡霉素A的纯度可稳定达到98％以上。
[0015]本专利技术提供一种寡霉素A的提纯方法，包括使用有机溶剂浸泡发酵液湿菌渣后过滤得到浸提液，制备层析得到层析液，并经过精制得到目标产品。
[0016]作为一种具体的实施方式，所述的制备层析为反相填料高压制备层析。
[0017]本专利技术进一步提供一种寡霉素A的提纯方法，其包括以下步骤：
[0018]a.发酵液浸提：取寡霉素A发酵液过滤得湿菌渣，使用有机溶剂浸泡后搅拌并过滤得到浸提液；
[0019]b.制备层析：将步骤a中得到的浸提液稀释过滤后，使用反相填料高压制备层析得到层析液；
[0020]c.精制：将步骤b中得到的层析液合并并浓缩，加入打浆溶液打浆并烘干后，得到目标产物。
[0021]作为一种具体的实施方式，其中步骤a中所述的有机溶剂为C1～C5的低沸点有机溶剂；所述的有机溶剂选自甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯中任一种或两种以上的混合；作为一种具体的实施方式，所述的有机溶剂优选为甲醇。
[0022]作为一种具体的实施方式，其中步骤a中所述的过滤可为滤布过滤。
[0023]作为一种具体的实施方式，其中步骤a中所述的浸提时间为1～24小时，例如2～18小时或3～12小时；作为一种具体的实施方式，所述的浸提时间为4～8小时；作为一种具体的实施方式，所述的浸提时间为5～6小时。
[0024]作为一种具体的实施方式，其中步骤a中所述的菌渣与有机溶剂用量的体积比为
1:1～1:10；作为一种具体的实施方式，所述的菌渣与有机溶剂用量的体积比为1:1.5～1:3。
[0025]作为一种具体的实施方式，其中步骤b中所述的过滤为滤膜过滤，所述的滤膜孔径小于等于0.45μm。
[0026]作为一种具体的实施方式，其中步骤b中所述的反相填料为C18填料，所述的C18填料的修饰类型选自BP、P、ODS、AQ或Amide修饰的不同孔径和粒径的填料。
[0027]作为一种具体的实施方式，所述步骤b中反相填料优选为C1810μm
[0028]作为一种具体的实施方式，所述步骤b中反相色谱的载样量为0.5～10g/L，例如1～8g/L、2～7g/L、3～6g/L、4～5g/L；作为一种具体的实施方式，所述步骤c中反相色谱的载样量优选为2～3g/L。
[0029]作为一种具体的实施方式，所述步骤b中反相色谱的制备流速为1～5BV/h，例如1～4V/h、2～3V/h；作为一种具体的实施方式，所述步骤c中反相色谱的制备流速优选为2～4V/h。
[0030]作为一种具体的实施方式，所述步骤b中反相色谱的有机相选自甲醇、乙醇、乙腈和丙酮，优选甲醇。
[0031]作为一种具体的实施方式，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种寡霉素A的提纯方法，包括使用有机溶剂浸泡发酵液湿菌渣后过滤得到浸提液，制备层析得到层析液，并经过精制得到目标产品；其特征在于，所述的制备层析为反相填料制备层析。2.一种如权利要求1所述的寡霉素A提纯方法，其包括如下步骤：a.发酵液浸提：取寡霉素A发酵液过滤得湿菌渣，使用有机溶剂浸泡后搅拌并过滤得到浸提液；b.制备层析：将步骤a中得到的浸提液稀释过滤后，使用反相填料高压制备层析得到层析液；c.精制：将步骤b中得到的层析液合并并浓缩，加入打浆溶液打浆并烘干后，得到目标产物。3.一种如权利要求2所述的寡霉素A提纯方法，所述步骤a中使用的有机溶剂为C1～C5的低沸点有机溶剂，所述的有机溶剂选自甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯中任一种或两种以上，优选甲醇；和/或，所述步骤a中浸提时间为1～24小时，优选6～8小时；和/或，所述步骤a中菌渣与有机溶剂用量的体积比为1:1～1:10，优选1:1.5～1:3。4.一种如权利要求2所述的寡霉素A提纯方法，所述步骤b中的反相填料为C18填料，所述C18填料的修饰类型选自BP、P、ODS、AQ、Amide，优选为C18和/或，所述步骤b中反相色...

【专利技术属性】
技术研发人员：周陈峰，张扬，吴开凯，张翔，侯宏波，朱家骏，张正，陈斌，
申请(专利权)人：杭州中美华东制药有限公司，
类型：发明
国别省市：