一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用，所述制备方法包括以下步骤：步骤1、预处理肝肿瘤组织；步骤2、分步酶解；利用酶溶液分步酶解步骤1中的预处理后的肝肿瘤组织，并过滤后收集每一步的酶解液，得到细胞悬液；步骤3、梯度离心；利用细胞分离液对细胞悬液进行梯度离心，分离免疫细胞和肝实质细胞；步骤4、红细胞裂解；用红细胞裂解液对步骤3获得的免疫细胞进行红细胞裂解，并离心清洗，获得免疫细胞沉淀；步骤5、收集步骤3中的肝实质细胞和步骤4中的免疫细胞沉淀，用细胞清洗液清洗后离心获得细胞沉淀，用细胞重悬液重悬细胞沉淀并过滤，得到所述肝肿瘤组织单细胞悬液。液。液。

【技术实现步骤摘要】
一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种用于肝肿瘤组织解离的方法，特别是肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]肝脏是肿瘤好发部位之一，良性肿瘤较少见，多以原发性的恶性肿瘤为主，其中转移性肿瘤较多。原发性肿瘤可发生于肝细胞索、胆管上皮、血管或其他中胚层组织部位，成人、儿童均可发病。早期肝恶性肿瘤患者主要以手术切除、肝移植和消融法等方式开展治疗，晚期患者的治疗方法主要有经导管肝动脉化疗栓塞以及靶向药物治疗。尽管现有疗法取得了一定的进展，但是疗效依旧有限，因此研究肝恶性肿瘤的异质性将有助于解析疾病的演进及发现新的治疗靶点，为临床治疗提供新思路和方案。
[0003]单细胞测序技术越来越多地应用到解析肿瘤微环境中复杂细胞类型的相互作用关系，以阐述疾病的发生发展以及微环境中的动态演化过程。它可以在单细胞分辨率下探测细胞和微环境的异质性，通过单细胞基因组学、转录组学、表观基因组学、蛋白质组学和代谢组学等多维度单细胞测序数据，解析肿瘤细胞和免疫细胞及其他微环境中的成员的种类、比例、状态等从而阐明肿瘤生物行为的潜在机制，其在促进肿瘤谱系诊断、靶向治疗和预后预测方面的应用前景十分广泛。然而由于单细胞测序需要大量来源于目标组织的高活性(活率80％以上)的单细胞，并且期望获得的细胞类型尽可能贴近在体组织的类型及比例。然而，当前常用的肝肿瘤解离方法获得的单细胞悬液整体细胞数有限、活率偏低，并且会造成某些较为脆弱的细胞，特别是肝实质细胞的缺失。而实际研究中肝实质细胞在肝肿瘤的演进中起举足轻重的作用，因此保持细胞比例接近真实体内环境对于研究疾病靶点和指导临床用药十分重要。
[0004]由于目前大多数通过分离新鲜组织来获得肝肿瘤组织细胞的方法，尚不适用于单细胞分析实验。因此，开发一种高效的、高细胞活力的、可用于单细胞实验的肝肿瘤单细胞悬液的制备方法，有利于提高单细胞实验结果的质量，加速单细胞相关实验在肝肿瘤研究中的应用。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术可能造成单细胞悬液活率低、细胞类型不够全面的缺陷，本专利技术提供了一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法。通过分步酶解和梯度离心分离法确保多种细胞类型得率并保证细胞活性。
[0006]本专利技术提供的肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1、预处理预处理肝肿瘤组织(冲洗和修剪所述肝肿瘤组织，得到预处理后的组织)；
[0008]步骤2、分步酶解，利用酶溶液分步酶解步骤1中的预处理后的肝肿瘤组织，并过滤后收集每一步的酶解液，得到细胞悬液(使用一定量的酶解液对步骤1中获得的预处理后的
肿瘤组织进行一定时间的酶解和孵育，通过细胞滤网过滤收集酶解液的上清液，得到细胞悬液；对酶解液剩余沉淀可继续加入一定量的酶解液，重复操作进行多次酶解)；
[0009]步骤3、梯度离心；利用细胞分离液对细胞悬液进行梯度离心，分离免疫细胞和肝实质细胞；(将一定量的密度梯度分离液和PBS混合均匀形成不同浓度的细胞分离液体。利用细胞分离液梯度离心，以分离免疫细胞和肝实质细胞，清洗并在一定条件下离心，获得细胞沉淀)；
[0010]步骤4、红细胞裂解；用红细胞裂解液对步骤3获得的免疫细胞进行红细胞裂解，并离心清洗，获得免疫细胞沉淀(用一定量的红细胞裂解液对步骤3获得的免疫细胞沉淀进行红细胞裂解，清洗并在一定条件下离心，获得细胞沉淀)；
[0011]步骤5、收集步骤3中的肝实质细胞和步骤4中的免疫细胞沉淀，用细胞清洗液清洗后离心获得细胞沉淀，用细胞重悬液重悬细胞沉淀并过滤，得到所述肝肿瘤组织单细胞悬液(用一定量的细胞清洗液清洗清洗细胞沉淀并在一定条件下离心，用一定量的细胞重悬液重悬细胞并过滤，得到所述肝肿瘤组织单细胞悬液)。
[0012]所述步骤1具体为：将肝肿瘤组织用预冷的PBS溶液冲洗，并修剪组织块，选用结构完整的组织，避免血凝块。
[0013]优选的，步骤1具体为：将所述肝肿瘤肿瘤组织用4℃预冷的PBS溶液冲洗2～3次，并用消毒过的剪刀修剪组织块，选用结构完整的组织，避免血凝块。
[0014]步骤2中，所述的酶溶液是质量浓度为0.1％～0.5％的II型胶原酶，其酶活单位不低于125CDU/mg。
[0015]所述步骤2包括如下步骤：
[0016]步骤2.1、4
‑
8℃条件下将步骤1所得的组织放入5
‑
10mL酶解液中，在酶解液中用剪刀物理剪碎肿瘤组织至1
ꢀ‑
2mm3的尺寸，进行初步酶解；初步酶解的处理条件为：37℃下，水浴摇床孵育5～10min；孵育结束后利用70
‑
100μm滤膜过滤，收集初步酶解的滤液，4
ꢀ‑
8℃暂存；
[0017]步骤2.2、沉淀继续加入5
ꢀ‑
10mL所述的酶溶液进行二次酶解，37℃水浴摇床孵育5～10min；孵育结束后过滤，收集二次酶解滤液，和步骤2.1收集的初步酶解的滤液混合，即得细胞悬液。
[0018]可进行2
‑
4次酶消化过程。
[0019]步骤3所述密度梯度分离液为Percoll细胞分离液。
[0020]所述步骤3具体为：4
ꢀ‑
8℃，300
‑
400g条件下将步骤2得到的细胞悬液离心，沉淀重悬于2～3mL的预冷PBS中，制备成细胞分散液；在离心管中依次加入3mL Percoll分离液3、3ml Percoll分离液2和2～3ml的细胞分散液进行梯度离心；所述梯度离心的条件为400g，4℃，升降速选择第4档，20～30min；离心后底层为免疫细胞红细胞，介于Percoll分离液3和Percoll分离液2的中间层为肝实质细胞层；分离并收集免疫细胞红细胞和肝实质细胞层。
[0021]所述Percoll分离液2的制备方法为：Percoll和10x PBS溶液按体积比9：1混合，得到Percoll分离液1；Percoll分离液1和10x PBS溶液按体积比3
‑
4：7混匀得到Percoll分离液2；
[0022]所述Percoll分离液3的制备方法为：Percoll和10x PBS溶液按体积比9：1混合，得到Percoll分离液1；Percoll分离液1和10x PBS溶液按体积比1：1混匀得到Percoll分离液
2。
[0023]步骤4具体包括如下步骤：
[0024]将步骤3收集的免疫细胞红细胞加入红细胞裂解液常温下裂解3
‑
5min；红细胞裂解结束后加入细胞清洗液，400g，5～10min离心，收集免疫细胞。
[0025]所述Percoll分离液2和Percoll分离液3的配置方法是：先使用9倍体积Percoll和1倍体积10x PBS溶液混匀得到Percoll分离液1；使用3倍体积Percoll分离液1和7倍体积PBS溶液混匀得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、预处理肝肿瘤组织；步骤2、分步酶解；利用酶溶液分步酶解步骤1中的预处理后的肝肿瘤组织，并过滤后收集每一步的酶解液，得到细胞悬液；步骤3、梯度离心；利用细胞分离液对细胞悬液进行梯度离心，分离免疫细胞和肝实质细胞；步骤4、红细胞裂解；用红细胞裂解液对步骤3获得的免疫细胞进行红细胞裂解，并离心清洗，获得免疫细胞沉淀；步骤5、收集步骤3中的肝实质细胞和步骤4中的免疫细胞沉淀，用细胞清洗液清洗后离心获得细胞沉淀，用细胞重悬液重悬细胞沉淀并过滤，得到所述肝肿瘤组织单细胞悬液。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：将肝肿瘤组织用预冷的PBS溶液冲洗，并修剪组织块，选用结构完整的组织，避免血凝块。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述的酶溶液是质量浓度为0.1％～0.5％的II型胶原酶，其酶活单位不低于125CDU/mg。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2包括如下步骤：步骤2.1、4
‑
8℃条件下将步骤1所得的组织放入5
‑
10mL酶解液中，在酶解液中用剪刀物理剪碎肿瘤组织至1
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2mm3的尺寸，进行初步酶解；初步酶解的处理条件为：37℃下，水浴摇床孵育5～10min；孵育结束后利用70
‑
100μm滤膜过滤，收集初步酶解的滤液，4
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8℃暂存；步骤2.2、沉淀继续加入5
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10mL所述的酶溶液进行二次酶解，37℃水浴摇床孵育5～10min；孵育结束后过滤，收集二次酶解滤液，和步骤2.1收集的初步酶解的滤液混合，即得细胞悬液。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述细...

【专利技术属性】
技术研发人员：何牮，周献超，孟梅，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：