化合物EGTA在制备预防或治疗猪流行性腹泻药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于动物疫病防控技术领域，具体涉及一种化合物EGTA在制备预防或治疗猪流行性腹泻药物中的应用。本发明专利技术意外发现化合物EGTA能够抑制PEDV在真核生物细胞内的增殖，对PEDV具有一定的抑制作用，可抑制PEDV在细胞内的感染扩增，可用于制备预防或治疗猪流行性腹泻药物，为PED的防控奠定一定的技术基础，具有广阔的应用前景。的应用前景。的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
化合物EGTA在制备预防或治疗猪流行性腹泻药物中的应用


[0001]本专利技术属于动物疫病防控
，具体涉及一种化合物EGTA在制备预防或治疗猪流行性腹泻药物中的应用。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的病毒性传染病，患病猪主要表现出腹泻、呕吐、厌食、脱水以及体重下降等临床症状。所有年龄段的猪都可以被PEDV感染，表现出不同程度的患病特征，一般来说，成年猪表现出轻微的感染症状或者无症状，仔猪多为重症感染，致死率可以高达100％，给生猪养殖行业带来了巨大的经济损失。由于PEDV变异较快，使得疫苗的防控效果较为有限。因此，开发相关预防治疗用药对于防控PED具有十分重要的技术意义。
[0003]EGTA是一种化学物质，即乙二醇双(2
‑
氨基乙基醚)四乙酸，分子式是C14H24N2O10。其中有文献公开了即EGTA能够促进猪轮状病毒和牛疱疹病毒4型(BoHV
‑
4)的产生，即EGTA对猪轮状病毒和牛疱疹病毒的复制具有促进作用。
[0004]而本专利技术意外发现，化合物EGTA能够显著抑制PEDV的复制，降低PEDV滴度，可用于制备抗PEDV感染的药物，用于预防或治疗PED，具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0005]针对上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种化合物EGTA在制备预防或治疗猪流行性腹泻药物中的应用。具体包括以下内容：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种EGTA或其药学上可接受的盐在制备抗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用，所述EGTA的结构式如下式(Ⅰ)所示：
[0007][0008][0009]优选地，所述EGTA或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
[0010]第二方面，本专利技术提供了一种EGTA或其药学上可接受的盐在制备预防猪流行性腹泻药物中的应用，所述EGTA的结构式如下式(Ⅰ)所示：
[0011][0012]优选地，所述EGTA或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
[0013]第三方面，本专利技术提供了一种EGTA或其药学上可接受的盐在制备治疗猪流行性腹泻药物中的应用，所述EGTA的结构式如下式(Ⅰ)所示：
[0014][0015]优选地，所述EGTA或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
[0016]本专利技术的有益效果是：本专利技术意外发现，化合物EGTA能够显著抑制PEDV的复制和增殖，可用于制备抗PEDV感染的药物，用于预防或治疗PED，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0017]图1EGTA对Vero细胞PEDV N mRNA的影响；
[0018]图2EGTA对Vero细胞PEDV N蛋白表达水平的影响；
[0019]图3EGTA对LLC
‑
PK1细胞PEDV N mRNA的影响。
具体实施方式
[0020]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0021]实施例1EGTA处理后病毒mRNA变化的测定
[0022]方法：1)将Vero细胞进行消化传代，按照1
×
105个/mL接种到12孔细胞培养板1mL/孔。37℃、5％ CO2培养箱中培养；2)细胞密度到70％左右使用2.5M EGTA处理细胞30min；3)1MOI PEDV感染处理后的细胞。将培养基更换为新鲜的血清含量为3％的DMEM培养基，在病毒感染后2与4h收取细胞；4)使用trizol裂解液裂解提取细胞中的RNA，详细操作按照trizol的说明书进行；5)对提取的RNA进行反转录，按照500ng/10μL的量进行，详细操作按照反转录试剂盒说明书进行；6)对反转录后的样品进行实时荧光定量PCR检测。详细的操作按照荧光定量PCR聚合酶说明书进行，荧光定量引物的信息如下：
[0023]PEDV N
‑
F:TGGTGGCTGCTGTCAAGG(SEQ ID NO.1所示)；
[0024]PEDV N
‑
R:TTTTCGACAAATTCCGCAT(SEQ ID NO.2所示)；
[0025]Actin
‑
F:ATCGTGCGTGACATTAAG(SEQ ID NO.3所示)；
[0026]Actin
‑
R:ATTGCCAATGGTGATGAC(SEQ ID NO.4所示)。
[0027]结果：具体结果如图1所示，可以看出：荧光定量PCR检测表明，EGTA处理组的PEDV N mRNA显著低于对照组，说明EGTA能够抑制PEDV在Vero细胞中的复制。
[0028]实施例2EGTA处理后病毒蛋白变化的测定
[0029]方法：1)将Vero细胞进行消化传代，按照1
×
105个/mL接种到12孔细胞培养板1mL/孔。37℃、5％ CO2培养箱中培养；2)细胞密度到70％左右使用2.5M EGTA处理细胞30min。接种1MOI的PEDV，轻轻摇晃培养板混匀；3)1MOI PEDV感染处理后的细胞。将培养基更换为新鲜的血清含量为3％的DMEM培养基，在病毒感染后6与12h收取细胞；4)使用RIPA裂解液对细胞进行冰上裂解30min，4℃12000rpm/min离心10min。收集上清，加入5
×
loading buffer，沸水中煮样10min后
‑
80℃冰箱中保存备用；5)将购买的12％的预制胶置于垂直电泳槽中，加入电泳缓冲液。将处理好的细胞样品以及Marker加入点样孔中进行电泳；6)200V进行电泳跑胶50min；7)电泳结束后，将蛋白胶与PVDF膜一起置于夹子中，加入电转缓冲液进行转膜。转印时间为60min；8)使用5％的脱脂奶粉对转印好的PVDF膜进行封闭；9)使用5％的脱脂奶粉稀释的一抗孵育PVDF膜1h；10)PBST洗膜3次，5min/次。使用HRP标记的二抗孵育PVDF膜1h；11)PBST洗膜3次，5min/次。置于ECL发光液中片刻，于显色仪器中进行曝光。
[0030]结果：具体结果如图2所示，可以看出：Western Blot检测表明，EGTA处理组的PEDV N蛋白显著低于对照组，说明EGTA能够抑制PEDV的蛋白合成。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.EGTA或其药学上可接受的盐在制备抗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用，所述EGTA的结构式如下式(Ⅰ)所示：2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述EGTA或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。3.EGTA或其药学上可接受的盐在制备预防猪流行性腹泻药物中的应用，所述EGTA的结构式如下式(Ⅰ)所示：4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖书奇，郭旭阳，郑海学，赵晓静，马志倩，李志伟，李洋，郑紫方，冯英桐，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：