线粒体用于制备减重药物的应用制造技术

本发明专利技术属于肥胖症治疗技术领域，具体涉及线粒体用于制备减重药物的应用。具体方案中，所述药物为静脉注射。所述药物为静脉注射。

【技术实现步骤摘要】
线粒体用于制备减重药物的应用


[0001]本专利技术属于超重与肥胖症治疗
，具体涉及线粒体用于制备减重药物的应用。

技术介绍

[0002]随着膳食结构和生活方式的剧变，超重与肥胖已经成为全球各国共同面对的公共卫生难题。因此，治疗与预防超重、肥胖症，对于遏制肥胖症流行具有十分重要的临床意义。超重与肥胖症是由遗传、环境和饮食行为等因素共同作用导致的体内脂肪过度蓄积的营养障碍性慢性代谢性疾病，主要特征为体内脂肪过度蓄积和体重超重。
[0003]传统的超重与肥胖症治疗方法包括运动锻炼、饮食控制等，但治疗效果个体差异比较大，体重易反弹。减肥手术也因为有严重的手术和代谢并发症的风险以及高额的手术费用，使得大多数肥胖患者得不到理想的治疗。而市场与临床上广泛使用的减肥药物在带来良好减肥疗效的同时，也存在着严重的安全问题。而新兴的肠道菌群移植术、代谢靶点抑制剂/拮抗剂等治疗方法还在试探中应用，安全有效性有待评估，并未推广。

技术实现思路

[0004]专利技术人研究发现，在充足饮食或限制饮食的情况下，注射线粒体后对小鼠起到了减重、减肥的作用。
[0005]基于此本专利技术提供了线粒体用于制备减重药物的应用。具体方案中，所述药物为静脉注射。
附图说明
[0006]图1.本专利技术实施例血小板来源线粒体的形态鉴定；Mito
‑
Tracker Red标记的是血小板内线粒体和分离的线粒体；BF：明场；PLT：血小板；Mito：血小板来源线粒体。
[0007]图2.本专利技术实施例血小板来源线粒体的纯度和功能鉴定；A.Western blotting鉴定血小板来源线粒体的纯度，TOMM20和COXⅣ为线粒体内参蛋白，GAPDH为胞质内参蛋白；B.血小板来源线粒体的线粒体膜电位检测；Mito：血小板来源线粒体；CCCP是一种强效的线粒体氧化磷酸化解偶联剂，促使线粒体内膜对H
+
产生通透性，导致线粒体内膜两侧的膜电位丧失，作为阳性对照；N＝3，*P<0.05,**P<0.01,****P<0.0001。
[0008]图3.C57BL/6小鼠经过三次线粒体静脉注射后的日均体重增长率；A.充足饮食方式；B.限制饮食方式；Ctrl：对照组；Mito：线粒体静脉注射组。N＝3，*P<0.05。
具体实施方式
[0009]除非有特殊说明，本文中的科学与技术术语根据相关领域普通技术人员的认识理解。
[0010]本专利技术所述减重是指生物体重量减小，包括脂肪的减少。
[0011]本专利技术所述线粒体不限来源，例如，可来自血小板、其他血液细胞、间充质干细胞或组织等；线粒体的获取可采用现有线粒体提取方法、现有线粒体提取试剂盒在相应组织中提取，具体提取过程对于本领域技术人员均为常规操作。以下实施例选用血小板线粒体为例，对本专利技术做进一步解释说明，但适用于本专利技术的线粒体并不限于此。
[0012]实施例1：
[0013]该实施例为血小板线粒体的提取：
[0014]1.血小板准备
[0015]取1mL富血小板血浆，加入4mL含抗凝剂的PBS(抗凝剂:PBS＝1:9)轻柔混匀，1800rpm离心10min，小心去除上清获得纯血小板。
[0016]2.血小板来源线粒体的制备
[0017]①
血小板来源线粒体的提取使用Qproteome Mitochondria Isolation Kit(#37612,Qiagen)；将血小板颗粒重悬于1mL的冰浴的Lysis Buffer中，用1mL移液枪头上下吹打混匀；在4℃的摇床上孵育10分钟，使血小板充分裂解。
[0018]②
在4℃下，将血小板裂解物以1000g离心10分钟，小心去除上清液，这部分主要含有胞质蛋白。
[0019]③
用1mL的移液枪上下移液，将血小板裂解物颗粒重悬在1mL冰浴的Disruption Buffer中；使用钝头针和注射器完成细胞破坏，慢慢地将裂解物吸入注射器，然后一次排出，重复10次。
[0020]④
在4℃下以1000g离心裂解液10min，并小心地将上清液转移到干净的1.5mL管中。
[0021]⑤
在4℃下以6000g将来自步骤
④
的上清液离心10min；小心地吸出上清液；沉淀颗粒中含有目标提取物线粒体，将线粒体用500μL PBS重悬，冰浴保存。
[0022]3.血小板来源线粒体形态鉴定
[0023]①
将Mito
‑
Tracker Red CMXRos(#C1049B,Beyotime)按照1:1000的比例稀释于PBS中配制成工作液，37℃预热后与血小板混合重悬；血小板与Mito
‑
Tracker Red CMXRos工作液在37℃孵育15
‑
30min后，1800rpm离心10min，弃上清。
[0024]②
使用含抗凝剂的PBS洗涤血小板两遍，以充分除去Mito
‑
Tracker Red CMXRos工作液。
[0025]③
将一部分Mito
‑
Tracker Red CMXRos标记的血小板重悬于PBS置于4℃冰箱保存，然后按照步骤2将剩余Mito
‑
Tracker Red CMXRos标记的血小板用于线粒体提取。
[0026]④
线粒体提取完成后，在激光共聚焦显微镜(Olympus FluoView FV1000,Tokyo,Japan)下观察血小板和提纯线粒体在明场(BF)下的形态，以及Mito
‑
Tracker Red对线粒体的标记定位情况。结果如图1所示，制备的颗粒大小和线粒体大小接近，说明成功分离到细胞器微粒，不含完整的血小板；红色荧光标记说明分离到的微粒含有线粒体成分，获得线粒体。
[0027]4.血小板来源线粒体纯度和功能鉴定
[0028]①
血小板来源线粒体纯度鉴定
[0029]a.分离血小板线粒体后，使用RIPA裂解液(#P0013C,Beyotime)在4℃下裂解细胞30min，然后用loading buffer(#P0015L,Beyotime)在100℃下加热10min使蛋白变性。
[0030]b.采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测线粒体内参蛋白TOMM20、COXⅣ和胞质内参蛋白GAPDH的含量，评价提取的线粒体纯度。
[0031]②
血小板来源线粒体功能鉴定
[0032]通过测定线粒体膜电位来评价分离的线粒体功能，操作步骤按照JC
‑
1线粒体膜电位检测试剂盒(#C2006,Beyotime)说明书进行。
[0033]a.取适量JC
‑
1(200X)，按照每50μL JC
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.线粒体用于制备减重药物的应用。2.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡兴斌，陈要臻，陈禹彤，安宁，吴晓双，王文婷，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：