一种酶法制备超低分子量石斛寡聚糖的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种酶法制备超低分子量石斛寡聚糖的方法及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术采用来源于嗜热菌Thermobifida halotolerans的糖苷酶，重组至大肠杆菌表达系统，实现了高活性表达。重组表达的ThDPS酶可以水解石斛多糖，产生的寡聚糖产物主要包括超低分子量(分子量<1000道尔顿)石斛二糖、石斛三糖、石斛四糖、石斛五糖，和低分子量(分子量<10000道尔顿)的石斛六糖、石斛七糖、石斛八糖及以上石斛寡糖产物。本发明专利技术为生物法制备超低分子量石斛寡糖奠定了技术基础，适合于工业化生产与应用。生产与应用。生产与应用。

【技术实现步骤摘要】
一种酶法制备超低分子量石斛寡聚糖的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种酶法制备超低分子量石斛寡聚糖的方法及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo，D.officinale)为兰科石斛属的珍稀传统药材，包括1500多种植物，目前被收载于药食同源目录。随着人们生活水平质量的提高，传统中药材的应用需求愈发广泛，其中铁皮石斛化学成分及药理活性是目前石斛研究领域的热点与重点。大量药理活性研究表明，铁皮石斛具有免疫调节、抗肿瘤、抗突变、降血压、降血脂、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗辐射、抗溃疡、抗衰老等功效。除药用外，石斛作为保健食品已有几千年的历史。因此这些活性成分在提高免疫力、抗衰老、抗疲劳等方面进行中成药制剂成品与保健品的开发极具前景。近年来，从具有药理活性的40多种石斛中分离出将近100种活性化合物，包括:石斛多糖、石斛碱、联苄酚、氨基酸、黄酮、萜类、微量元素等。
[0003]石斛多糖目前研究较为广泛的活性成分为多糖，其中铁皮石斛多糖(Dendrobium officinale polysaccharide，DOP)主要是甘露糖、葡萄糖通过糖苷键形成的葡甘露聚糖，有研究发现，铁皮石斛多糖具有保护胃黏膜、调节血糖、保肝、增强免疫力、降血脂等多种活性。近年来研究发现，低分子量聚多糖具有更强的生物活性，比如低分子量甘露寡糖也能通过刺激肝脏分泌甘露结合蛋白，激活补体系统发挥调理和天然抗感染免疫的功能，对肠道病原微生物有很好的识别、黏附和排除作用。由于天然石斛聚糖分子量高、粘稠度大，使其在医药和食品加工领域的使用受到限制。石斛多糖糖苷键在酸性溶液中易断裂，形成不同聚合度的水解物，因此酸法催化水解是降解植物多糖较为常用的方法。硫酸、三氟乙酸及盐酸催化辅助沸水浴加热或直接利用加热设备高温加热水解铁皮石斛多糖，耗时长，酸的浓度大，加热设备易损坏、成本高。三氟乙酸、盐酸极易挥发、刺激呼吸系统、有毒，操作时难易控制浓度，不适合规模化地水解多糖制备甘露糖。而最近报道的采用霉菌发酵石斛多糖制备低分子量石斛多糖的技术被开发，但其发酵时间长，反应产物复杂难分离，且制备的分子量在10000Da以上，因此难以实现工业化制备需求。因而这些因素导致了医药级和食品级的寡糖生产成本居高不下。

技术实现思路

[0004]本专利技术为解决制备石斛多糖中小分子活性寡糖制备存在的诸多缺陷问题，采用生物酶法催化降解石斛多糖，由于生物酶法反应条件温和、专一性高、且产品纯度高，易于实现工业化生产制备。
[0005]本专利技术提供了嗜热菌(Thermobifida halotolerans)来源的糖苷酶或表达所述糖苷酶的重组微生物在水解石斛多糖方面的应用。
[0006]在一种实施方式中，所述嗜热菌(Thermobifida halotolerans)来源的糖苷酶具
有SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。
[0007]在一种实施方式中，编码所述糖苷酶的基因具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0008]在一种实施方式中，所述微生物包括但不限于大肠杆菌。
[0009]本专利技术还提供一种制备超低分子量石斛寡聚糖的方法，所述方法是将所述糖苷酶或含所述糖苷酶的细胞培养物用于石斛多糖的降解。
[0010]在一种实施方式中，所述超低分子量石斛寡聚糖的分子量≤1000Da，包括但不限于石斛二糖、石斛三糖、石斛四糖。
[0011]在一种实施方式中，所述方法是将所述糖苷酶或含所述糖苷酶的细胞培养物加入至高分子石斛多糖溶液中。
[0012]在一种实施方式中，所述高分子石斛多糖溶液中多糖的分子量≥1
×
104Da。
[0013]在一种实施方式中，所述高分子石斛多糖溶液中多糖的分子量为1
×
104～1
×
107Da。
[0014]在一种实施方式中，所述石斛多糖用50mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制成浓度为1
‑
100g/L的溶液。
[0015]在一种实施方式中，所述溶液中石斛多糖的浓度为10g/L。
[0016]在一种实施方式中，所述糖苷酶的添加量≥1U/g
石斛多糖
，具体可以为1
‑
1000U/g
石斛多糖
，或500U/g
石斛多糖
。
[0017]在一种实施方式中，参与石斛多糖降解的糖苷酶是不含其它盐的纯酶液，酶在反应体系中的浓度为10
‑
10000U/L，具体可以为5000U/L。
[0018]在一种实施方式中，所述反应体系溶液的pH值控制在5.0～10.0之间，具体可以为pH7.0。
[0019]在一种实施方式中，所述反应体系的温度在10℃
‑
75℃之间，具体可以为60℃。
[0020]在一种实施方式中，所述反应体系的反应时间为0.5
‑
16h，具体可以为2h。
[0021]本专利技术还提供所述糖苷酶或所述方法在生产含石斛寡糖的产品中的应用。
[0022]在一种实施方式中，所述高分子石斛多糖可被水解为≤1000道尔顿的超低分子量石斛寡糖，包括但不限于石斛二糖、石斛三糖、石斛四糖、石斛五糖，或水解为1000～10000道尔顿的石斛六糖、石斛七糖、石斛八糖及以上寡糖等。
[0023]有益效果：
[0024](1)本专利技术提供了嗜热菌Thermobifida halotolerans来源的糖苷酶在水解石斛多糖方面的应用。
[0025](2)本专利技术在重组大肠杆菌异源表达嗜热菌Thermobifida halotolerans来源的糖苷酶，并通过优化糖苷酶的编码基因，获得表达活性显著提高的ThDPS表达产物，实现了ThDPS酶的高效活性表达，由于大肠杆菌拥有较强的蛋白表达能力，易于ThDPS酶的大规模发酵制备，以本专利技术重组表达的嗜热糖苷酶ThDPS可以直接用于石斛多糖的高效水解，实现活性寡糖规模化酶法催化制备。
[0026](3)本专利技术利用基因工程菌株发酵所制酶直接用于降解石斛多糖制备寡聚糖小分子，反应条件极其简单，对仪器设备无要求，在常温常压下即可实施；酶水解工艺不需添加任何有机试剂，无任何污染废弃物产生；小分子寡糖的转化产率达95％以上，产物在水溶液
100ul尿素，标准样品加入6M 10uL尿素，振荡混匀于
‑
20℃冰箱中放置过夜。
[0045]分离胶制作：30％丙烯酰胺5.33mL、1.5M Tirs
‑
Hcl(pH8.8)1mL、蒸馏水1.67mL、10％过硫酸铵30uL、TEMEO 10uL，混匀制胶。
[0046]电泳完成后把取出的胶放到紫外灯下观察条带。
[0047]实施例1：多种糖苷酶重组大肠杆菌的异源表达与制备
[0048]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.嗜热菌(Thermobifida halotolerans)来源的糖苷酶或表达所述糖苷酶的重组微生物在水解石斛多糖方面的应用，其特征在于，所述糖苷酶具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述糖苷酶的基因具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述重组微生物包括但不限于大肠杆菌。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述重组微生物以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET21a为表达载体，表达所述糖苷酶。5.一种制备超低分子量石斛寡聚糖的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的糖苷酶或含所述糖苷酶的细胞培养物用于石斛多糖的降解。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述超低分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：金鹏，杜琪珍，斯金平，俞巧仙，解东超，刘京晶，
申请(专利权)人：浙江森宇有限公司，
类型：发明
国别省市：