一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA及其防治方法技术

本发明专利技术涉及一种苹果斑点落叶病真菌跨界致病的milRNA(Alt

【技术实现步骤摘要】
一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA及其防治方法


[0001]本专利技术涉及植物分子生物学领域，具体说是一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA及其防治方法。

技术介绍

[0002]milRNA介导的跨界调控在植物与病原体相互作用中起着重要作用。真菌milRNA已被证明通过调节大丽花轮枝菌、稻瘟病菌和苹果腐烂病中的毒力基因参与植物侵染过程。然而，植物病原真菌的milRNAs介导的跨界调控的功能和机制在很大程度上仍是未知的。苹果斑点落叶病是苹果最主要真菌性病害，侵染苹果叶片后是苹果在生长早期落叶，对苹果的产量产生巨大的影响，因此，探究苹果斑点落叶病的致病机制及防治方法十分必要。

技术实现思路

[0003]针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA及其防治方法。本专利技术通过比较苹果接种苹果斑点落叶病Alternaria sp.mali(ALT1)前后milRNA的表达差异，得到了一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA，命名为Alt
‑
milR823。研究发现与未接种苹果斑点落叶病ALT1、苹果炭疽叶枯病GLS1(Glomerella leaf spot)与苹果褐斑病MLS1(Marssonina leaf spot)的苹果感病品种GL
‑
3相比，接种了ALT1、GLS1与MLSl后的GL
‑
3中Alt
‑
milR823的表达均上升，苹果叶片注射瞬时过表达Alt
‑
milR823载体可增强苹果对ALT1、GLS1与MLS1的易感性。另外，在接种了ALT1、GLS1与MLS1的GL
‑
3的叶片中可以观察到Alt
‑
milR823的存在。进一步通过5
‘
RACE验证Alt
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milR823在10
‑
11位点靶向切割其靶基因Md
‑
PECL4。过表达靶基因后，在GL
‑
3中接种ALT1、GLS1与MLS1后，Alt
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mi1R823的表达量下降。因此专利技术人通过过表达靶基因Md
‑
PECL4开发了抗斑点落叶病的分子手段。
[0004]为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0005]一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA(命名为Alt
‑
milR823)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0006]一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA的初级转录本(命名为Alt
‑
MILR823)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0007]一种检测斑点落叶病感病叶片跨界milRNA的原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0008]S1：取接菌48h后叶片和未接菌叶片，先分别在RNase浸泡15min，然后用pH 7.4的1
×
PBS洗涤3次；
[0009]S2：将经S1处理的叶片样品放置于4％多聚甲醛真空浸润15min，至样品下沉，变成半透明状，然后放到4℃冰箱过夜；
[0010]S3：所有样品用1
×
PBS冲洗3次，每次间隔5min。
[0011]S4：经S3处理的样品放置于添加20μg/mL蛋白酶K和0.5％Triton
‑
X的TE缓冲液中37℃处理2
‑
3h，以消化细胞内多余的RNA酶和蛋白质，并渗透细胞以进入探针；
[0012]S5：经S4处理的样品在pH 7.4的1x PBS中冲洗3次，每次冲洗间隔5分钟；
[0013]S6：在室温下用0.2％甘氨酸浸泡5分钟，以停止蛋白酶活性；
[0014]S7：经S6甘氨酸处理后，样品用4％多聚甲醛固定5分钟，再次在1x PBS缓冲液中冲洗；
[0015]S8：将LNA和FAM修饰后的探针在50％甲酰胺中85℃变性3min，然后立即冰浴5min；
[0016]S9：将经S8获得的20μL浓度为35μM的探针溶液和作为无探针对照的20μL的50％甲酰胺，分别连同80μL的杂交缓冲液加入到装有经S7处理样品的样品管中，50℃，300rpm过夜孵育；
[0017]S10：将0.2
×
SSC缓冲液加入经S9处理的样品管中，50℃，300rpm清洗30min，上述清洗重复一次；
[0018]S11：将包含0.1％碘化丙啶的0.2
×
SSC缓冲液加入经S10处理的样品管中，37℃，300rpm清洗5min；
[0019]S12：将包含0.1％碘化丙啶的0.2
×
SSC缓冲液加入经S11处理的样品管中，室温，300rpm清洗5min；
[0020]S13：用0.2
×
SSC缓冲液漂洗经S12处理的样品，去色。
[0021]在上述方案的基础上，所述的经LNA和FAM修饰后的探针的序列如SEQ ID NO：3所示。
[0022]一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA的靶基因(命名为Md
‑
PECL4)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0023]一种植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为包含检测斑点落叶病感病叶片跨界传递致病的milRNA的pFGC5941载体。
[0024]一种工程菌，其特征在于，包含上述植物表达载体(该植物表达载体为包含检测斑点落叶病感病叶片跨界传递致病的milRNA的pFGC5941载体)。
[0025]一种植物表达载体，其特征在于，包含上述靶基因的pFGC5941载体。
[0026]一种工程菌，其特征在于，包含上述的植物表达载体(该植物表达载体为包含上述靶基因的pFGC5941载体)。
[0027]一种提高苹果植株对苹果斑点落叶病抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0028]S1：通过CTAB方法提取感病苹果总RNA；
[0029]S2：将经S1提取的总RNA逆转录成cDNA；
[0030]S3：利用S2得到的逆转录的模板和RT
‑
PCR引物克隆权利要求5所述的靶基因；
[0031]S4：将S3得到的靶基因插入pFGC5941载体上的BamHI和NcoI两个酶切位点中，转入大肠杆菌DH5 α中；
[0032]S5：将经S4构建的过表达靶基因载体提取质粒；
[0033]S6：将S5提取的质粒转入农杆菌中，涂布于加有抗生素的固体YEP培养基上，将平板于28℃倒置培养24
‑
48h；上述抗生素包含50mg/L Kana，20mg/L Rif
[0034]S7：经S6培养的农杆菌挑取单斑，加入包含5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.如权利要求1所述一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的milRNA的初级转录本，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.一种检测斑点落叶病感病叶片跨界milRNA的原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：取接菌48h后叶片和未接菌叶片，先分别在RNase浸泡15min，然后用pH 7.4的1
×
PBS洗涤3次；S2：将经S1处理的叶片样品放置于4％多聚甲醛真空浸润15min，至样品下沉，变成半透明状，然后放到4℃冰箱过夜；S3：所有样品用1
×
PBS冲洗3次，每次间隔5min；S4：经S3处理的样品放置于添加20μg/mL蛋白酶K和0.5％Triton
‑
X的TE缓冲液中37℃处理2
‑
3h，以消化细胞内多余的RNA酶和蛋白质，并渗透细胞以进入探针；S5：经S4处理的样品在pH 7.4的1x PBS中冲洗3次，每次冲洗间隔5分钟；S6：在室温下用0.2％甘氨酸浸泡5分钟，以停止蛋白酶活性；S7：经S6甘氨酸处理后，样品用4％多聚甲醛固定5分钟，再次在1x PBS缓冲液中冲洗；S8：将LNA和FAM修饰后的探针在50％甲酰胺中85℃变性3min，然后立即冰浴5min；S9：将经S8获得的20μL浓度为35μM的探针溶液和作为无探针对照的20μL的50％甲酰胺，分别连同80μL的杂交缓冲液加入到装有经S7处理样品的样品管中，50℃，300rpm过夜孵育；S10：将0.2
×
SSC缓冲液加入经S9处理的样品管中，50℃，300rpm清洗30min，上述清洗重复一次；S11：将包含0.1％碘化丙啶的0.2
×
SSC缓冲液加入经S10处理的样品管中，37℃，300rpm清洗5min；S12：将包含0.1％碘化丙啶的0.2
×
SSC缓冲液加入经S11处理的样品管中，室温，300rpm清洗5min；S13：用0.2
×
SSC缓冲液漂洗经S12处理的样品，去色。4.如权利要求3所述的一种检测斑点落叶病感病叶片跨界milRNA的原位杂交方法，其特征在于，所述的经LNA和FAM修饰后的探针的序列如SEQ ID NO:3所示。5.一种如权利要求1所述一种苹果斑点落叶病真菌跨界传递致病的mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：张秋雷，唐金琦，李天忠，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：