一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用。利用本发明专利技术设计的sgRNA组，对绵羊DYA基因进行编辑，发生基因编辑后可造成大片段缺失并导致移码突变，对DYA基因编码的蛋白质结构和功能造成较大破坏。实验结果表明：在目标区域可造成不同片段长度的基因编辑，1号外显子总体编辑效率达到76.4％，2号外显子总体编辑效率达到84.09％。基因组中的两套染色体上均发生编辑(即纯合子)：1号外显子纯合子编辑效率为30.9％；2号外显子纯合子编辑效率为9.1％。本发明专利技术提供的sgRNA组在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9技术为目前最常用的基因编辑技术，此前所用的同源重组、ZFN(锌指核酸酶)、TANLEN(转录激活样效应核酸酶)等技术也可以实现目的基因的大片段精确敲除，但细胞内自然发生同源重组的效率极低。ZFN、TALEN技术的设计繁琐，成本更高且效率较低，而CRISPR/Cas9技术的基因编辑效率较高，并可以介导同源重组，相比于ZFN和TALEN，Cas9系统更具优势。利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，需要首先根据基因组序列设计Sg(single
‑
guide，单链引导)序列，目标基因中一般可设计多个sg序列，但序列的位置碱基顺序会对其编辑靶基因的效率有影响，使用高编辑效率的sg序列更容易获得目标基因编辑的细胞或受精卵，减少获得基因编辑细胞或动物个体的实验时间及成本。
[0003]DYA(MHCclassIIantigenDYalpha)基因即MHCII类抗原DYα。DYA基因仅在反刍类动物淋巴组织，皮肤组织和脾脏等组织中表达，DYA表达的蛋白主要位于树突状细胞表面，在免疫应答过程中发挥重要作用。DYA在反刍动物中表达的特异性及其功能，在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。现有报导中，没有针对绵羊DYA基因进行编辑的报道，没有针对DYA基因使用CRISPR/Cas9系统实现编辑的实例。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用。本专利技术提供的sgRNA组可以利用CRISPR/Cas9技术对绵羊DYA基因进行编辑，在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种靶向DYA基因的sgRNA组，所述sgRNA组包括Exon1
‑
sgRNA和/或Exon2
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sgRNA；
[0007]所述Exon1
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sgRNA包括Exon1
‑
sgRNA1和Exon1
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sgRNA2；
[0008]所述Exon1
‑
sgRNA1包括Exon1
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sgRNA1
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F和Exon1
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sgRNA1
‑
R；所述Exon1
‑
sgRNA2包括Exon1
‑
sgRNA2
‑
F和Exon1
‑
sgRNA2
‑
R；
[0009]所述Exon1
‑
sgRNA1
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述Exon1
‑
sgRNA1
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0010]所述Exon1
‑
sgRNA2
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述Exon1
‑
sgRNA2
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0011]所述Exon2
‑
sgRNA包括Exon2
‑
sgRNA1和Exon2
‑
sgRNA2，所述Exon2
‑
sgRNA1包括Exon2
‑
sgRNA1
‑
F和Exon2
‑
sgRNA1
‑
R；所述Exon2
‑
sgRNA2包括Exon2
‑
sgRNA2
‑
F和Exon2
‑
sgRNA2
‑
R；
[0012]所述Exon2
‑
sgRNA1
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Exon2
‑
sgRNA1
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0013]所述Exon2
‑
sgRNA2
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述Exon2
‑
sgRNA2
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0014]本专利技术还提供了扩增上述方案所述sgRNA组的靶标序列的引物对，所述引物对包括引物对1和/或引物对2；
[0015]所述引物对1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
[0016]所述引物对2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述引物对2的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
[0017]本专利技术还提供了一种敲除DYA基因的质粒组，所述质粒组包括Exon1
‑
sgRNA质粒组和/或Exon2
‑
sgRNA质粒组；
[0018]所述Exon1
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sgRNA质粒组包括Exon1
‑
sgRNA1质粒和Exon1
‑
sgRNA2质粒；所述Exon1
‑
sgRNA1质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon1
‑
sgRNA1和px330质粒；所述Exon1
‑
sgRNA2质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon1
‑
sgRNA2和px330质粒；
[0019]所述Exon2
‑
sgRNA质粒组包括Exon2
‑
sgRNA1质粒和Exon2
‑
sgRNA2质粒；所述Exon2
‑
sgRNA1质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon2
‑
sgRNA1和px330质粒；所述Exon2
‑
sgRNA2质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon2
‑
sgRNA2和px330质粒。
[0020]优选的，所述px330质粒包括经BbsⅠ酶后的px330大片段质粒。
[0021]本专利技术还提供了上述方案所述sgRNA组或上述方案所述的引物对或上述方案所述的质粒组在编辑DYA基因中的应用。
[0022]优选的，所述DYA基因包括绵羊的DYA基因。
[0023]优选的，所述绵羊包括湖羊。
[0024]本专利技术还提供了上述方案所述sgRN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向DYA基因的sgRNA组，其特征在于，所述sgRNA组包括Exon1
‑
sgRNA和/或Exon2
‑
sgRNA；所述Exon1
‑
sgRNA包括Exon1
‑
sgRNA1和Exon1
‑
sgRNA2；所述Exon1
‑
sgRNA1包括Exon1
‑
sgRNA1
‑
F和Exon1
‑
sgRNA1
‑
R；所述Exon1
‑
sgRNA2包括Exon1
‑
sgRNA2
‑
F和Exon1
‑
sgRNA2
‑
R；所述Exon1
‑
sgRNA1
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述Exon1
‑
sgRNA1
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述Exon1
‑
sgRNA2
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述Exon1
‑
sgRNA2
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述Exon2
‑
sgRNA包括Exon2
‑
sgRNA1和Exon2
‑
sgRNA2，所述Exon2
‑
sgRNA1包括Exon2
‑
sgRNA1
‑
F和Exon2
‑
sgRNA1
‑
R；所述Exon2
‑
sgRNA2包括Exon2
‑
sgRNA2
‑
F和Exon2
‑
sgRNA2
‑
R；所述Exon2
‑
sgRNA1
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Exon2
‑
sgRNA1
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述Exon2
‑
sgRNA2
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述Exon2<...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秋月，陈燕，马润林，王大祥，蔡实实，蒋柏林，
申请(专利权)人：江苏乾宝牧业有限公司，
类型：发明
国别省市：