一种利用大肠杆菌联产丁二酸与戊二胺的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用大肠杆菌联产丁二酸与戊二胺的方法。（1）以产赖氨酸的大肠杆菌NT1003

【技术实现步骤摘要】
一种利用大肠杆菌联产丁二酸与戊二胺的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用大肠杆菌联产丁二酸与戊二胺的方法。

技术介绍

[0002]生物基聚酰胺(PA)材料以可再生生物质资源作为原料，通过生物合成二元酸、二元胺等单体，再通过聚合制备，在合成纤维、工程塑料等领域有着重要的应用。生物基PA5.4可由生物基丁二酸与戊二胺作为聚合单体合成，具有优良的力学与加工性能。目前，Bioamber公司、Myriant公司、Reverdia公司等均已实现了丁二酸的产业化，上海凯赛生物技术股份有限公司、宁夏伊品生物科技股份有限公司也实现了单体戊二胺的工业化生产。因此，未来生物基PA5.4的发展前景广阔，有望部分取代PA6.6在纤维与工程塑料等领域的应用，缓解PA6.6由于前体己二胺依赖进口而发展受限的局面。
[0003]PA5.4以戊二胺和丁二酸为单体，在合成过程中会出现产物积累导致的酸/碱问题，因此会添加其他酸或者碱来进行中和，最后导致产生过量的废盐。本方法通过改造底盘细胞，赋予细胞联产戊二胺和丁二酸的能力，可以实现酸碱的中和，进而减少酸/碱的反复添加。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种利用大肠杆菌联产丁二酸与戊二胺的方法，该方法实现了在一个细胞内戊二胺和丁二酸联产，可以使得酸碱中和，进而减少酸/碱的反复添加。为了解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：
[0005]一种利用大肠杆菌联产丁二酸与戊二胺的方法，包括以下步骤：
[0006]步骤1，以产赖氨酸的大肠杆菌NT1003
△
Met
△
Thr为出发菌株，构建生产丁二酸的大肠杆菌GSY01；
[0007]步骤2，以生产丁二酸的大肠杆菌GSY01为底盘细胞，导入赖氨酸脱羧酶，构建生产1,5
‑
戊二胺的大肠杆菌GSY02；
[0008]步骤3，利用生产1,5
‑
戊二胺的大肠杆菌GSY02，实现戊二胺和丁二酸的合成，其中，具体过程为，将发酵体系分成好氧阶段和厌氧阶段，用诱导启动子调控赖氨酸脱羧酶合成，在好氧阶段实现细胞快速增长和赖氨酸的合成，在厌氧阶段实现戊二胺和丁二酸的合成。
[0009]作为改进的是，步骤(1)中所述产赖氨酸的大肠杆菌NT1003
△
Met
△
Thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M2013239。
[0010]作为改进的是，步骤1中，构建生产丁二酸的大肠杆菌GSY01的步骤如下：
[0011]第一步，以大肠杆菌NT1003
△
Met
△
Thr为出发菌株，通过CRISPR
‑
Cas9编辑技术敲除乳酸脱氢酶基因(ldh)，获得大肠杆菌GSY01
‑
1；
[0012]第二步，以大肠杆菌GSY01
‑
1为出发菌株，通过CRISPR
‑
Cas9编辑技术敲除乙醇脱
氢酶(ackA)，获得大肠杆菌GSY01。经代谢改造后，丁二酸合成能力明显提高，由之前的1g/L提高至4g/L。
[0013]作为改进的是，步骤2中构建生产1,5
‑
戊二胺的大肠杆菌GSY02，包括以下步骤：
[0014]第一步，以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，通过PCR扩增获得赖氨酸脱羧酶的编码基因cadA；
[0015]第二步，以pET28a(+)为载体质粒，选择酶切位点Nco I和Xho I；
[0016]第三步，通过酶切连接的方式，将cadA基因亚克隆到pET28a(+)载体质粒上，获得重组质粒pET28a
‑
cadA；
[0017]第四步，将重组质粒pET28a
‑
cadA导入大肠杆菌GSY01中，获得生产1，5
‑
戊二胺的大肠杆菌GSY02。
[0018]作为改进的是，步骤3中发酵生产丁二酸和戊二胺，包括以下步骤：
[0019]步骤a，选取生产1，5
‑
戊二胺的大肠杆菌GSY02，在LB平板上活化20～32h；
[0020]步骤b，将活化后的生产1，5
‑
戊二胺的大肠杆菌GSY02接种于种子培养基中，33～40℃扩大培养8～16h；
[0021]步骤c，将活化的种子培养基，按接种量1％～5％接种于发酵培养基中，在35～40℃培养；
[0022]步骤d，首先，在好氧条件下培养20～30h，让细胞合成并积累L
‑
赖氨酸；
[0023]步骤e，在培养20～30h后，添加终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG，同时，将发酵体系切换成厌氧条件，诱导表达赖氨酸脱羧酶，催化赖氨酸合成戊二胺。
[0024]作为改进的是，步骤d中所述好氧培养条件为200rpm；步骤e中，所述厌氧条件为将转移到蓝盖瓶，并密封，不外加搅拌。
[0025]本专利技术的联产流程工艺：
[0026]诱导启动子调控赖氨酸脱羧酶合成，包括乳糖操纵子、四环素操纵子或者其他信号(包括物理、化学信号)诱导表达的操纵子形式。好氧阶段下，生产1，5
‑
戊二胺的大肠杆菌GSY02以细胞生长和赖氨酸合成为主要任务，快速积累细胞量和赖氨酸。经诱导表达赖氨酸脱羧酶后，进入第二阶段及厌氧阶段。厌氧阶段下，生产1，5
‑
戊二胺的大肠杆菌GSY02合成赖氨酸脱羧酶，对发酵体系中的赖氨酸进行催化，合成戊二胺。同时，厌氧条件下，重组大肠杆菌因代谢改造，会快速合成丁二酸。
[0027]有益效果：
[0028]与现有技术相比，本专利技术一种利用大肠杆菌联产丁二酸与戊二胺的方法，具有如下优势：
[0029]1、本专利技术通过诱导表达调控赖氨酸脱羧酶，将戊二胺的合成分成赖氨酸积累和戊二胺合成两阶段，同时耦合好氧及厌氧发酵两阶段，实现好氧下细胞生长和赖氨酸生长及厌氧下合成戊二胺和丁二酸的两阶段发酵，实现了在一个细胞内戊二胺和丁二酸联产。
[0030]2、本专利技术赖氨酸合成戊二胺的过程中会释放二氧化碳，在厌氧发酵的条件下，KA303可以利用二氧化碳合成丁二酸，减少二氧化碳排放。
[0031]3、本专利技术由于戊二胺的生产会使反应pH提高，而丁二酸的合成会使pH降低，通过联产戊二胺和丁二酸，可以使得酸碱中和，进而减少酸/碱的反复添加。
附图说明
[0032]图1为好氧/厌氧两阶段培养大肠杆菌联产丁二酸和戊二胺代谢途径图；
[0033]图2为本专利技术好氧阶段的生物量；
[0034]图3为本专利技术好氧阶段的赖氨酸含量；
[0035]图4为本专利技术联产后戊二胺与丁二酸浓度图。
具体实施方式
[0036]以下通过具体实施方式的描述对本专利技术作进一步说明，但这并非是对本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用大肠杆菌联产丁二酸与戊二胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，以产赖氨酸的大肠杆菌NT1003
△
Met
△
Thr为出发菌株，构建生产丁二酸的大肠杆菌GSY01；步骤2，以生产丁二酸的大肠杆菌GSY01为底盘细胞，导入赖氨酸脱羧酶，构建生产1,5
‑
戊二胺的大肠杆菌GSY02；步骤3，利用生产1,5
‑
戊二胺的大肠杆菌GSY02发酵生产丁二酸和戊二胺。2.根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产丁二酸与戊二胺的方法，其特征在于，步骤1中所述产赖氨酸的大肠杆菌NT1003
△
Met
△
Thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M2013239。3.根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产丁二酸与戊二胺的方法，其特征在于，步骤1中，构建生产丁二酸的大肠杆菌GSY01的步骤如下：第一步，以大肠杆菌NT1003
△
Met
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Thr为出发菌株，通过CRISPR
‑
Cas9编辑技术敲除乳酸脱氢酶基因 (ldh)，获得大肠杆菌GSY01
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1；第二步，以大肠杆菌GSY01
‑
1为出发菌株，通过CRISPR
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Cas9编辑技术敲除乙醇脱氢酶 (ackA)，获得大肠杆菌GSY01。4.根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产丁二酸与戊二胺的方法，其特征在于，步骤2中构建生产1,5

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，高思远，陆佳晨，王永涛，许晟，王昕，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：