一种发酵生产苹果酸的方法技术

本发明专利技术属于发酵技术领域，具体公开了一种发酵生产苹果酸的方法。本发明专利技术的方法通过在发酵过程中交替进行需氧发酵和厌氧发酵，可有效阻止发酵产生的CO2从排气处逃逸，使该部分CO2完全进入代谢途径，一方面加强CO2的固定，避免浪费，另一方面减少CO2排放，保护环境。并且，当发酵进入厌氧发酵阶段时，不需要向发酵罐内通入无菌空气，减少了无菌空气的使用量，节约了能源。与现有方法相比，本发明专利技术发酵生产苹果酸的方法在一定程度上提高了苹果酸产量及总酸转化率，避免了由于长期厌氧发酵导致的菌体活力下降，节约了资源，降低了生产成本。降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产苹果酸的方法


[0001]本专利技术属于发酵
，具体涉及一种发酵生产苹果酸的方法。

技术介绍

[0002]苹果酸是一种二元酸，又名2
‑
羟基丁二酸，分子式为C4H6O5，因1785年由Scheele从未成熟的苹果中分离而得名，分为L
‑
苹果酸、D
‑
苹果酸、DL
‑
苹果酸三种构型。常温常压下，苹果酸是一种白色结晶状粉末，易溶解于水，微溶解于乙醇。L
‑
苹果酸的口感柔和，在食品、医药等领域具有广泛的用途。例如，在食品领域作为世界第三大食品酸味剂(排在柠檬酸、乳酸之后)，在医药领域作为抗癌药物前体，在化工领域作为化妆品添加剂，同时其聚合物还可用于合成生物塑料。
[0003]目前，苹果酸的生产方法主要有三种方法：(1)化学合成法：主要以石油为原料，生产得到的苹果酸浓度高、后处理操作简单且售价较低，因此具有很大的市场竞争力。然而，化学合成法存在着设备损耗严重、需要高温高压条件以及产品没有立体选择性等缺点。(2)酶转化法：以富马酸为底物，经富马酸酶的催化作用转化为L
‑
苹果酸，该方法的优点主要是工艺简单和转化率高，但同时也存在明显的缺点，包括生产成本较高以及残留富马酸难以去除，因此也限制了酶转化法的大规模应用。(3)微生物发酵法：利用嗜热毁丝霉、米曲霉、黑曲霉、青霉、黑粉菌等丝状真菌发酵生产苹果酸。相较于上述两种方法，微生物发酵法具有原料来源丰富、成本低廉以及食用安全性高等优点，近些年来受到研究者的广泛关注。
[0004]在微生物体内，苹果酸合成有五种途径：(1)草酰乙酸直接还原合成苹果酸，葡萄糖经这一途径每合成1分子L
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苹果酸需固定1分子CO2，其最大理论得率为2mol苹果酸/mol葡萄糖。(2)经TCA循环氧化柠檬酸合成苹果酸，该途径1分子葡萄糖合成L
‑
苹果酸需释放2分子CO2，其最大理论转化率仅为1mol苹果酸/mol葡萄糖。(3)由草酰乙酸经乙醛酸循环合成苹果酸，其最大理论转化率为1mol苹果酸/mol葡萄糖。(4)由乙酰辅酶A和草酰乙酸经乙醛酸循环合成苹果酸，最大理论转化率为1.33mol苹果酸/mol葡萄糖。(5)丙酮酸直接羧化合成苹果酸，最大理论转化率为2mol苹果酸/mol葡萄糖。
[0005]虽然苹果酸合成有多条途径，但是很多都与CO2的固定密切相关。因此，平衡各个代谢途径至关重要。江南大学刘龙团队以米曲霉体系为出发菌株，通过表达丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶强化还原型TCA途径，使得苹果酸产量达到42.3g/L，而后通过进一步加强糖酵解途径及苹果酸转运能力，使苹果酸产量提升至165g/L。同时，中国专利CN106148209B公开了一种经遗传改造的苹果酸合成工程菌株，以嗜热毁丝霉或异梭毁丝霉为出发菌株，通过导入外源性二元有机酸合成正调控基因(表达C4
‑
二羧酸转运蛋白)，构建得到能显著提高苹果酸生产能力的基因工程菌株。
[0006]综上可知，为了提高苹果酸发酵水平，降低发酵成本，研究者通过微生物代谢工程研发了多个苹果酸发酵菌种。但是，现有技术很少从发酵工艺的角度进行优化。因此，亟需开发一种新的发酵方法来平衡各个代谢途径。

技术实现思路

[0007]本专利技术主要解决的技术问题是提供一种发酵生产苹果酸的方法，通过在发酵过程中交替进行需氧发酵与厌氧发酵，加强CO2的固定，提高苹果酸产量及总酸转化率，节约资源，减少CO2排放，保护环境。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种发酵生产苹果酸的方法，所述方法通过在发酵过程中交替进行需氧发酵和厌氧发酵，制备得到含有苹果酸的发酵液。
[0009]作为本专利技术一种优选的实施方案，所述方法先进行需氧发酵，至发酵中期时，由需氧发酵(首次)转为厌氧发酵，之后交替进行需氧发酵和厌氧发酵，至发酵结束。优选地，所述发酵中期为需氧发酵50
‑
70h时，进一步优选为发酵60
‑
70h时，更优选为发酵64h时，由需氧发酵首次转为厌氧发酵。
[0010]作为本专利技术一种优选的实施方案，所述方法在发酵的中后期，由厌氧发酵转为需氧发酵的条件为：发酵液每小时耗糖量小于1.155g/L；优选小于1.145g/L。之后，由需氧发酵(非首次)转为厌氧发酵的条件为：发酵液每小时耗糖量大于1.175g/L；优选大于1.185g/L。为了更准确地调整需氧/厌氧发酵阶段，优选在线检测葡萄糖变化情况，例如在发酵的全过程或中后期使用在线生化分析仪对反应体系中的葡萄糖含量进行监测。
[0011]作为本专利技术一种优选的实施方案，所述需氧发酵的过程中，控制发酵液中的溶氧量为10％
‑
30％。所述控制溶氧量采用控制通风比、搅拌转速的方式，所述通风比为1：(0.1
‑
0.3)V/V
·
m，所述搅拌转速为200
‑
500rpm。需氧发酵时，向发酵罐内通入一定量的无菌空气，控制通风比和搅拌转速；转为厌氧发酵之后，停止通入无菌空气。
[0012]作为本专利技术一种优选的实施方案，所述发酵的菌株为嗜热菌，优选嗜热毁丝霉。所述嗜热毁丝霉选自野生型菌株或基因工程菌株。所述基因工程菌株可以选用专利CN106148209B公开的导入有外源性二元有机酸合成正调控基因(表达C4
‑
二羧酸转运蛋白)的嗜热毁丝霉工程菌株。
[0013]作为本专利技术一种优选的实施方案，所述发酵的过程中控制发酵温度为40
‑
50℃。在发酵过程中，发酵温度均保持在上述范围内。
[0014]作为本专利技术一种优选的实施方案，所述发酵的过程中控制发酵罐压强为0.02
‑
0.05MPa。在发酵过程中，发酵罐压强均保持在上述范围内。
[0015]作为本专利技术一种优选的实施方案，所述发酵的接种量为2
‑
10％(v/v)。
[0016]作为本专利技术一种优选的实施方案，所述发酵的培养基(每升)由以下组分组成：葡萄糖180
‑
250g，豆粕粉150
‑
200g，K2HPO
4 0.1
‑
0.3g，KH2PO
4 0.1
‑
0.3g，MgSO4·
7H2O 0.05
‑
0.2g，生物素0.1
‑
0.3mg，苹果酸0.01
‑
0.1g，NaCl 0.05
‑
0.1g，ZnSO4·
7H2O 0.05
‑
0.2g，FeSO4·
7H2O 0.1
‑
0.2g，水(如自来水)为溶剂。
[0017]优选地，所述发酵的培养基(每升)由以下组分组成：葡萄糖220g，豆粕粉180g，K2HPO
4 0.15g，KH2PO
4 0.15g，Mg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产苹果酸的方法，其特征在于，所述方法通过在发酵过程中交替进行需氧发酵和厌氧发酵，制备得到含有苹果酸的发酵液。2.根据权利要求1所述的发酵生产苹果酸的方法，其特征在于，所述方法先进行需氧发酵，至发酵中期时，由需氧发酵转为厌氧发酵，之后交替进行需氧发酵和厌氧发酵，至发酵结束；优选地，所述发酵中期为需氧发酵50
‑
70h时，进一步优选为需氧发酵64h时。3.根据权利要求1或2所述的发酵生产苹果酸的方法，其特征在于，所述方法在发酵的中后期，由厌氧发酵转为需氧发酵的条件为：发酵液每小时耗糖量小于1.155g/L；之后，由需氧发酵转为厌氧发酵的条件为：发酵液每小时耗糖量大于1.175g/L。4.根据权利要求1所述的发酵生产苹果酸的方法，其特征在于，所述需氧发酵的过程中，控制发酵液中的溶氧量为10％
‑
30％；优选地，所述控制溶氧量采用控制通风比、搅拌转速的方式，所述通风比为1：(0.1
‑
0.3)V/V
·
m，所述搅拌转速为200
‑
500rpm。5.根据权利要求1所述的发酵生产苹果酸的方法，其特征在于，所述发酵的菌株为嗜热菌，优选嗜热毁丝霉，所述嗜热毁丝霉选自野生型菌株或基因工程菌株。6.根据权利要求1或5所述的发酵生产苹果酸的方法，其特征在于，所述发酵的过程中控制发酵温度为40
‑
50℃。7.据权利要求1或5所述的发酵生产苹果酸的方法，其特征在于，所述发酵的过程中控制发酵罐压强为0.02
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：穆晓玲，常乐，杨金环，李维理，刘宗亮，王舒，
申请(专利权)人：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，
类型：发明
国别省市：