一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法技术

本发明专利技术公开一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法，属于生物技术领域。该方法结合了MMC和SFC两种适应性实验室进化方式，以甲醇作为筛选压力，来驱动毕赤酵母GS115菌株增加其对高甲醇的耐受性和利用率。该进化菌株的优良特性使其具有非常良好的工业应用前景，可广泛用于利用廉价甲醇碳源生产酶制剂和高值化学品，也为非灭菌型发酵生产提供可能性。此两种适应性结合的进化方法可以被应用于其他菌株的不同耐受条件的进化，并且大幅缩短进化周期，提高菌株耐受性。提高菌株耐受性。提高菌株耐受性。

【技术实现步骤摘要】
一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法，并根据该方法得到一株耐高甲醇浓度的毕赤酵母。

技术介绍

[0002]巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii，K. phaffii）（简称毕赤酵母）是一种典型的甲醇营养型酵母，可以利用甲醇作为唯一碳源和能源，因其拥有较成熟的蛋白分泌表达系统，成为受欢迎的微生物细胞工厂。但其对甲醇的利用率与同化效率不理想，甲醇及有毒代谢中间产物的积累对细胞具有毒性，不利于菌体生长和重组蛋白的大量生成。因此开发能够高效耐受甲醇的毕赤酵母菌株显得尤为重要。
[0003]适应性实验室进化又称定向进化、实验室进化，是利用微生物固有的“生物鲁棒性”，即特定的压力条件下，适应环境的正突变生物体能获得后代数量优势（如菌体生长速度，底物消耗速度，耐受高温、高或低pH值以及不同有机溶剂等），通过连续传代培养获得数量富集，在此基础上产生新的基因正突变以获得质量富集。长时间处于高甲醇浓度下的微生物会产生一系列基因型的变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：使用MMC和SFC两种适应性实验室进化的方式对毕赤酵母：首先使用MMC，以不同浓度甲醇为唯一碳源的液体培养基，对毕赤酵母进行进化，得到能够在3～6%甲醇浓度条件下生长的毕赤酵母菌株；然后通过SFC对获得的毕赤酵母菌株进一步进化，最终能在短时间内得到在8～20%甲醇浓度条件下正常生长的菌株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述毕赤酵母为毕赤酵母（Komagataellaphaffii）GS115。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：1）活化：将毕赤酵母进行活化，离心后收集菌体并弃上清，洗涤菌体两次后，将菌体接种在甲醇为碳源的液体培养基中进行培养，待菌株进入稳定期后用做MMC进化中的种子液；2）MMC进化：首先将步骤1）获得的种子液传代于0.1～1.0%甲醇浓度的液体培养基中，富集培养一定时间后，再依次传代于2.0%～5.0%甲醇浓度的液体培养基，连续传代15～30次，MMC进化所需总时间为300～500h；3）筛选：将长势较好的液滴筛选出来，划线，挑取单菌落在含有4%～6%甲醇浓度的液体培养基中进行摇瓶/平板发酵验证，筛选出能高效耐受甲醇的优良菌株，继续进行SFC进化；4）SFC进化：将MMC筛选到的优良菌株首先在含有0.1～1%甲醇浓度的液体培养基中活化培养，然后转移到含有4～10%甲醇浓度的液体培养基中进行培养一定时间；如果在一定时间内OD
600
达到8～15，进化菌株转移到含有下一个甲醇浓度的液体培养基中继续培养；如果没有，则将菌株转移到甲醇浓度相同培养基中继续培养；通过SFC进化共300～500h后，获...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩双艳，王帅，赵风光，林影，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：