一种乳酸片球菌的进化方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种乳酸片球菌的进化方法及其应用。所述方法中通过调整了培养基配方、初始pH、转接时间等条件。驯化得到的新菌株在低pH值条件下的L

【技术实现步骤摘要】
一种乳酸片球菌的进化方法及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种乳酸片球菌的进化方法及其应用。

技术介绍

[0002]L
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乳酸作为一种重要的工业化学品，广泛应用于食品、医药以及农业等行业。随着近几年环保意识的不断增强以及石油基塑料使用的不断降低，对于生物可降解塑料聚乳酸单体L
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乳酸的需求量在不断增加。据估计，2020年乳酸的全球需求量高达196万吨，然而全球的产量仅为60万吨，远远不足以满足乳酸的需求量。目前乳酸的合成主要靠的是微生物发酵生产，而木质纤维素资源丰富，利用木质纤维素来发酵生产乳酸具有重要的意义，即不存在与民争粮的问题，有助于实现“碳中和”的目标。
[0003]微生物发酵生产乳酸(pKa＝3.86)的过程中，需要添加大量的中和剂(Ca(OH)2、CaCO3、NaOH以及NH3·
H2O等)来维持微生物生长的pH值，这使得乳酸发酵得到的产物为乳酸钠或者乳酸钙等的乳酸盐。乳酸盐需要经过结晶以及酸化(浓硫酸等强酸)等步骤得到游离的乳酸，当在低pH值条件下进行乳酸发酵时，能够大量减少中和剂的使用，减少后期酸化的强酸用量或者不用经过酸化过程，避免高盐废水以及石膏等固体废弃物的产生，降低乳酸纯化的工艺成本。然而，在低pH值条件下生产乳酸，发酵菌株会受到来自低pH值的胁迫，低pH值条件下发酵菌株的生长会受到抑制，发酵指标会严重降低。因此，提高发酵菌株在低pH值条件下的L
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乳酸发酵性能对于降低L
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乳酸生产成本、减少后续纯化步骤至关重要。
[0004]目前，常用的提高菌株在低pH值条件下发酵性能的方法包括理性改造以及适应性进化等策略。理性改造的应用在提高菌株这一表型上经常由于这一表型的复杂性而受到阻碍，难以起到很明显的效果。而适应性进化策略已经被成功应用于提高菌株在高温、高盐以及抑制物等条件下的发酵性能。
[0005]专利申请号为200810242702.8的专利技术名称为“一种提高乳酸乳球菌抵御酸胁迫的方法”，公开了通过在培养液中添加3.2mmol/L谷胱甘肽提高了菌株在pH值4.0条件下的细胞存活率。该方法使用外源添加的谷胱甘肽提高乳酸乳球菌抵御酸胁迫的能力，不仅额外增加了乳酸的生产成本，而且仅仅提高了菌株在低pH值条件下的细胞存活率，并不能显著提高菌株在低pH值条件下的L
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乳酸产量。
[0006]专利申请号为201911198568.8的专利技术名称为“一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌”，公开了通过在逐渐增加乳酸浓度的培养基中进行长期适应性进化提高了大肠杆菌的乳酸耐受能力。该方法采用的出发菌株是大肠杆菌，而大肠杆菌对于木质纤维素来源的抑制物耐受较差，难以应用于纤维素L
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乳酸的生产。
[0007]专利申请号为201610651584.8的专利技术名称为“一株耐酸乳酸乳球菌及其应用”，公开了通过硫酸二乙酯诱变筛选得到耐酸的乳酸乳球菌。该方法采用诱变的方式，存在工作量巨大以及诱变方向不可控等问题。
[0008]目前尚未有能够显著提高发酵菌株在低pH值条件下L
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乳酸发酵性能的研究报道。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的之一在于提供一种乳酸片球菌的进化方法。
[0010]所述方法包括：以乳酸片球菌为出发菌株，使用两种以上乙酸盐含量不同的培养基对乳酸片球菌进行转接培养。
[0011]进一步地，所述培养基包括第一培养基、第二培养基、第三培养基。“第一”“第二”“第三”等用于对多个相同名称的产品进行区分，并非对其进行限定。
[0012]作为本专利技术的优选实施方式，所述方法包括以下步骤：
[0013]S1：以乳酸片球菌为出发菌株，使用第一培养基进行两阶段以上的转接培养；
[0014]S2：使用第二培养基和第一培养基进行交替培养；
[0015]S3：使用第三培养基对乳酸片球菌进行转接培养；
[0016]S4：使用第一培养基对乳酸片球菌进行转接培养至L
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乳酸发酵产量稳定；且所述第一培养基中乙酸盐含量高于所述第三培养基。所述乙酸盐包括但不限于乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵等，优选为乙酸钠。
[0017]进一步地，所述乳酸片球菌能够代谢葡萄糖和木糖产生L
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乳酸。
[0018]进一步地，所述乳酸片球菌能够耐受木质纤维素来源的抑制物。
[0019]“能够”代表出发菌株乳酸片球菌具备相应的能力。例如，可以是通过整合相关基因等方式进行菌株改造后得到具备上述能力的乳酸片球菌，并以其作为出发菌株进行在低pH值条件下发酵L
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乳酸能力的适应性进化。
[0020]进一步地，作为本专利技术的一实施方式，所述乳酸片球菌(出发菌株)为乳酸片球菌ZY271，保藏编号为CGMCC NO.13611，2017年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
[0021]作为本专利技术的一实施方式，步骤S1所述进行两阶段以上的转接培养包括第一阶段转接培养和第二阶段转接培养。
[0022]所述第一阶段转接培养过程包括：将乳酸片球菌在第一培养基中培养，每15～30h时转接一次，连续转接15～40次后进行第二阶段的培养。
[0023]优选地，所述第一阶段转接培养过程包括：将乳酸片球菌在第一培养基中培养，每20～24h后转接一次，连续转接18～30次后进行第二阶段的培养。进一步地，培养20～24h后培养基中残留葡萄糖含量达到10g/L以下。进一步地，培养过程中温度控制为40℃～48℃，搅拌转速控制为150～200rpm。
[0024]所述第二阶段转接培养过程包括：将乳酸片球菌在第一培养基中培养，每30～55h时转接一次，连续转接20～50次后完成第二阶段培养。
[0025]优选地，所述第二阶段转接培养过程包括：将乳酸片球菌在第一培养基中培养，每40～48h时转接一次，连续转接27～40次后完成第二阶段培养。进一步地，培养40～48h后培养基中残留葡萄糖含量达到7g/L以下。进一步地，培养过程中温度控制为40℃～48℃，搅拌转速控制为150～200rpm。
[0026]作为本专利技术的一实施方式，步骤S2所述交替培养过程包括：将乳酸片球菌在第二培养基中培养35～60h，而后转入第一培养基中培养，在第一培养基中培养15～30h，完成一次交替培养，再将乳酸片球菌转入第二培养基中重复上述过程，共进行5～20次的交替培养。
[0027]优选地，步骤S2所述交替培养过程包括：将乳酸片球菌在第二培养基中培养40～48h，而后转入第一培养基中培养，在第一培养基中培养20～24h，完成一次交替培养，再将乳酸片球菌转入第二培养基中重复上述过程，共进行9～15次的交替培养。即交替培养是在第二培养基、第一培养基之间交替进行。
[0028]进一步地，所述交替培养过程中温度控制为40℃～48℃，搅拌转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳酸片球菌的进化方法，其特征在于包括：以乳酸片球菌为出发菌株，使用两种以上乙酸盐含量不同的培养基对乳酸片球菌进行转接培养。2.根据权利要求1所述的方法，特征在于包括以下步骤：S1：以乳酸片球菌为出发菌株，使用第一培养基进行两阶段以上的转接培养；S2：使用第二培养基和第一培养基进行交替培养；S3：使用第三培养基对乳酸片球菌进行转接培养；S4：使用第一培养基对乳酸片球菌进行转接培养至L
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乳酸发酵产量稳定；所述第一培养基中乙酸盐含量高于所述第三培养基，所述乙酸盐包括但不限于乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵，优选为乙酸钠。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述乳酸片球菌能够代谢葡萄糖和木糖产生L
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乳酸；和/或，所述乳酸片球菌能够耐受木质纤维素来源的抑制物；和/或，所述乳酸片球菌为乳酸片球菌ZY271，保藏编号为CGMCC NO.13611。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一培养基中乙酸钠含量为0.4wt％以上，优选为0.4wt％～1.2wt％，更优选为0.4wt％～0.8wt％，更优选为0.4wt％～0.5wt％；和/或，所述第二培养基的初始pH值为3.8～4.8，进一步为4.0～4.5，优选地，所述第二培养基通过添加L
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乳酸或者柠檬酸调节培养基的初始pH值，所述L
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乳酸和柠檬酸的浓度优选为5wt％～15wt％，更优选为9wt％～10wt％；和/或，所述第二培养基为MRS培养基且乙酸钠含量为0.4wt％以上，优选为0.4wt％～1.2wt％，更优选为0.4wt％～0.8wt％，更优选为0.4wt％～0.5wt％；和/或，所述第三培养基为MRS培养基且乙酸钠含量为0.2wt％以下，优选为0.05wt％～0.2wt％，更优选为0.1wt％～0.2wt％。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养基中至少一种或全部选自MRS培养基或LBS培养基；优选地，所述MRS培养基包括乙酸钠和如下质量百分比的组分：一水合葡萄糖1％～5％、磷酸氢二钾0.05％～0.5％、蛋白胨0.05％～3％、柠檬酸氢二铵0.05％～0.5％、七水合硫酸镁0.01％～0.1％、一水合硫酸锰0.01％～0.08％，以及选自0.2％～2％的酵母提取物、0.2％～3％的玉米浆或玉米干酒糟中的至少一种组分；更优选地，所述MRS培养基包括乙酸钠和如下质量百分比的组分：一水合葡萄糖2.2％～3.3％、磷酸氢二钾0.1％～0.2％、蛋白胨0.5％～1％、柠檬酸氢二铵0.1％～0.2％、七水合硫酸镁0.05％～0.058％、一水合硫酸锰0.025％～0.05％，以及选自0.5％～1％的酵母提取物、0.5％～2％的玉米浆或玉米干酒糟中的至少一种组分；优选地，所述LBS培养基包括乙酸钠和如下质量百分比的组分：一水合葡萄糖1％～6％、蛋白胨0.1％～3％、柠檬酸三铵0.05％～0.5％、磷酸二氢钾0.2％～1％、硫酸亚铁0.001％～0.01％、硫酸镁0.01％～0.1％、一水合硫酸锰0.01％～0.1％、Tween 80 0.1～2mL/...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜钊，陈明星，贾佳，鲍杰，刘修才，
申请(专利权)人：CIBT美国公司，
类型：发明
国别省市：