本发明专利技术公开了一种次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌产生抗性的方法，本发明专利技术涉及生物相关领域，包括试验菌株选取，原代菌株活化，菌悬液制备，菌株MIC值测定，取10μL培养物液加入到10ml MH肉汤(MHB)中进行稀释，随后在96孔酶标板中先加入100μL含不同浓度梯度的消毒剂，再加入100μL稀释后的菌悬浮液(细菌数约106CFU)，菌株连续诱导，采用1/2最低抑菌浓度(MIC)的次氯酸钠溶液对菌株进行连续诱导，本发明专利技术通过次氯酸钠对细菌产生抗体进行诱导，采用1/2最低抑菌浓度(MIC)的次氯酸钠溶液对菌株进行连续诱导，研究次氯酸钠抗性菌株生理特征，对抗性产生机制和制定针对性的干预策略具有重要意义。有重要意义。有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌产生抗性的方法
[0001]本专利技术涉及生物相关领域，具体为一种次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌产生抗性的方法。
技术介绍
[0002]沙门氏菌引发的食物中毒在我国细菌性食物中毒事件中位居首位，每年病例超过300万，其中，肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis,S.Enteritidis)是最主要的血清型之一。次氯酸钠(Sodium hypochlorite,NaClO)是食品用消毒剂原料成分，被广泛应用在食品容器、食品生产经营工具、设备以及蔬菜水果的洗涤消毒。然而，细菌长期暴露于亚致死浓度的消毒剂中会诱导产生耐受性，影响实际消毒效果，对食品质量安全造成威胁。研究次氯酸钠抗性菌株生理特征，对抗性产生机制和制定针对性的干预策略具有重要意义。目前尚未有专利和文献具体报道如何利用次氯酸钠对肠炎沙门氏菌进行抗性诱导和检测。
技术实现思路
[0003]本专利技术的目的在于提供一种次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌产生抗性的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌产生抗性的方法，包括以下步骤：
[0005]步骤一：试验菌株选取
[0006]选取肠炎沙门氏菌S.Enteritidis CVCC 1806，来源于中国微生物菌种保藏中心，其保存在－80℃以下，传代为1
‑
5次；
[0007]步骤二：原代菌株活化
[0008]从
‑
80℃中取出冻存菌株，室温下融化，吸取0.4ml，接种至20ml TSB培养基中，温度控制在37℃，孵育24h；
[0009]步骤三：菌悬液制备
[0010]在无菌的环境下，将孵育24h的细菌细胞进行离心处理，温度控制在4℃，转速为10000rpm，离心5min，用0.85％(w/v)无菌生理盐水洗涤3次，然后重悬于0.85％(w/v)无菌生理盐水，得到109CFU/mL的菌悬液；
[0011]步骤四：菌株MIC值测定
[0012]取10μL培养物液加入到10ml MH肉汤(MHB)中进行稀释，随后在96孔酶标板中先加入100μL含不同浓度梯度的消毒剂，再加入100μL稀释后的菌悬浮液(细菌数约106CFU)；
[0013]同时设置阳性对照(接种100μL菌悬液和100μL空白MHB)和阴性对照(直接接种100μL空白MHB)；
[0014]每个样品设置2个重复，使用酶标板一次性封口膜将其密封，在37℃下培养18h，并采用酶标仪测定OD
600
值；
[0015]步骤五：菌株连续诱导
[0016]采用1/2最低抑菌浓度(MIC)的次氯酸钠溶液对菌株进行连续诱导；
[0017]具体为：
[0018]S5.1取原始菌株MIC的NaClO溶液10ml，与胰酪大豆胨液体培养基(TSB培养基)等体积混合，涡旋混匀，得到含1/2MIC NaClO溶液的TSB培养基，接入0.4ml孵育好的S.Enteritidis CVCC 1806，置于37℃孵育24h，计为第1代，测定其MIC值；
[0019]S5.2取第1代菌液MIC NaClO的溶液10ml，与胰酪大豆胨液体培养基(TSB培养基)等体积混合，涡旋混匀，得到含1/2MIC NaClO溶液的TSB培养基，接入0.4ml第一代菌液，置于37℃孵育24h，计为第2代，并测定其MIC值；
[0020]S5.3重复以上操作，当诱导过程中菌株MIC值增加，则胁迫溶液的浓度(1/2MIC)也相应提高；
[0021]S5.4诱导完成后，将诱导株在TSB培养基置于37℃孵育24h，进行传代培养，连续传代5次，每次传代后测定MIC值，观察诱导株稳定性；
[0022]步骤六：结果判定
[0023]MIC值判定，以96孔板中未观察到细菌可见生长(澄清孔)的最低消毒剂浓度作为MIC，以细菌A和B为例，MIC值分别为256和512mg/L；
[0024]OD
600
值判定，采用酶标仪测定OD600值，当OD≤0.1时，判定为澄清孔，反之则为浑浊孔。
[0025]综上所述，本专利技术有益效果是：
[0026]1、本专利技术通过次氯酸钠对细菌产生抗体进行诱导，采用1/2最低抑菌浓度(MIC)的次氯酸钠溶液对菌株进行连续诱导，研究次氯酸钠抗性菌株生理特征，对抗性产生机制和制定针对性的干预策略具有重要意义。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1为本专利技术一种次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌产生抗性的方法抗性结果判定示意图。
具体实施方式
[0029]本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0030]本说明书(包括任何附加权利要求、摘要和附图)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
[0031]下面结合图1对本专利技术进行详细说明，其中，为叙述方便，现对下文所说的方位规定如下：下文所说的上下左右前后方向与图1视图方向的前后左右上下的方向一致，图1为本专利技术装置的正视图，图1所示方向与本专利技术装置正视方向的前后左右上下方向一致。
[0032]请参阅图1，本专利技术提供的一种实施例：一种次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌产生抗性的方法，包括以下步骤：
[0033]步骤一：试验菌株选取
[0034]选取肠炎沙门氏菌S.Enteritidis CVCC 1806，来源于中国微生物菌种保藏中心，其保存在－80℃以下，传代为1
‑
5次；
[0035]步骤二：原代菌株活化
[0036]从
‑
80℃中取出冻存菌株，室温下融化，吸取0.4ml，接种至20ml TSB培养基中，温度控制在37℃，孵育24h；
[0037]步骤三：菌悬液制备
[0038]在无菌的环境下，将孵育24h的细菌细胞进行离心处理，温度控制在4℃，转速为10000rpm，离心5min，用0.85％(w/v)无菌生理盐水洗涤3次，然后重悬于0.85％(w/v)无菌生理盐水，得到109CFU/mL的菌悬液；
[0039]步骤四：菌株MIC值测定
[0040]取10μL培养物液加入到10ml MH肉汤(MHB)中进行稀释，随后在96孔酶标板中先加入100μL含不同浓度梯度的消毒剂，再加入100μL稀释后的菌悬浮液(细菌数约106CFU)；
[0041]同时设本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌产生抗性的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：试验菌株选取选取肠炎沙门氏菌S.Enteritidis CVCC 1806，其保存在－80℃以下，传代为1
‑
5次；步骤二：原代菌株活化从
‑
80℃中取出冻存菌株，室温下融化，吸取0.4ml，接种至20ml TSB培养基中，温度控制在37℃，孵育24h；步骤三：菌悬液制备用0.85％(w/v)无菌生理盐水洗涤3次，重悬于0.85％(w/v)无菌生理盐水，得到109CFU/mL的菌悬液；步骤四：菌株MIC值测定取10μL培养物液加入到10ml MH肉汤(MHB)中进行稀释，随后在96孔酶标板中先加入100μL含不同浓度梯度的消毒剂，再加入100μL稀释后的菌悬浮液(细菌数约106CFU)；步骤五：菌株连续诱导采用1/2最低抑菌浓度(MIC)的次氯酸钠溶液对菌株进行连续诱导；步骤六：结果判定。2.根据权利要求1所述的一种次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌产生抗性的方法，其特征在于：步骤三中，离心时，保持环境温度为4℃，离心速率为10000rpm，并持续5min。3.根据权利要求1所述的一种次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌产生抗性的方法，其特征在于：步骤四中同时设置阳性对照(接种100μL菌悬液和100μL空白MHB)和阴性对照(直接接种100μL空白MHB)，。4.根据权利要求1所述的一种次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌产生抗性的方法，其特征在于：步骤四中每个样品设置2个重复，使用酶标板一次性封口膜将其密封，在37℃下培养18h，并采用酶标仪...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪雯，肖兴宁，肖英平，杨华，王文思，吕文涛，马灵燕，马洁乐，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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