基于LC-MS/MS检测方法对鱼类色素代谢物的绝对定量分析方法技术

本发明专利技术公开了基于LC

【技术实现步骤摘要】
基于LC
‑
MS/MS检测方法对鱼类色素代谢物的绝对定量分析方法


[0001]本专利技术涉及靶向代谢组学
，特别是涉及一种基于LC
‑
MS/MS检测方法对鱼类色素代谢物的绝对定量分析方法。

技术介绍

[0002]靶向代谢组学(Targeted Metabolomics)是代谢组学研究的重要组成部分，也是全代谢组研究的延伸与拓展。靶向代谢组学是检测特定代谢物在样品中的含量。相对于全代谢组分析而言，靶向代谢组分析具有特异性强，检测灵敏度高和定量准确等特点。通过对血液、尿液或其他体液以及组织中某一特定的代谢物的富集与准确定量定性分析，一方面可以结合其它实验数据揭示相关的分子生物学作用机制，另一方面，也可以为后续代谢分子标志物的深入研究和开发利用提供有力支持。
[0003]选择性反应/多反应监测技术(SRM/MRM)，以标准品为参照，对特定代谢物群进行有针对性地、特异性地检测与分析，并可获得目标代谢物的绝对定量结果，具有特异性强、灵敏度高、准确性高的特点。SRM/MRM技术基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子对进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰。在定量分析过程中，该技术首先筛选目标代谢物特异性的母离子，然后选择性地对这些母离子进行碰撞诱导，去除其他离子的干扰，只对选定的MS/MS2离子进行质谱信号的采集，从而实现对目标代谢分子更为特异、灵敏、准确的分析。
[0004]代谢组学是通过分析代谢物浓度的变化来表征机体功能的变化，所以，代谢组学的最终目标是尽可能检测到所有的代谢物。一直以来，科学家们在代谢组学方法学平台的研究工作从未停止，但是到目前为止，还没有任何一种分析技术手段能检测到生物体内所有的小分子代谢物。当前，代谢组学主流的研究平台主要包括核磁共振光谱技术(NMR)，高效液相色谱质谱联用技术(HPLC
‑
MS/MS)和气相质谱联用技术(GC
‑
MS)。其中，核磁共振(NMR)技术能无歧视的分析各种样品，但其灵敏度低，对低浓度物质不能有效的响应；气相色谱质谱联用仪(GC
‑
MS)检测灵敏度高，但只对挥发性物质或衍生化后具有挥发性的物质进行检测，它们都有很大局限性。
[0005]前人在LC
‑
MS/MS的方法开发与应用方面已开展了广泛的研究。目前基于LC
‑
MS/MS的靶向代谢组学检测包括有中长链脂肪酸、断链脂肪酸、植物激素、类黄酮、神经递质、花青素、类固醇、类胡萝卜素、多胺和糖类等。检测过程中，通常只针对具有相似结构的某一类化合物，如中长链脂肪酸或花青素类物质，进行高通量检测；具有较大结构差异的物质，由于理化性质和热稳定性差异大，很难同时提取和分离，因此难以开展靶向代谢组学研究。
[0006]目前，鱼类色素相关代谢物尚没有开展代谢组学检测的报道，且由于鱼类色素相关代谢物结构复杂，理化性质差异巨大，既包括激素和神经递质，也有类胡萝卜素类物质及其二羟基衍生物、还有小信号分子和核苷酸等，很难对其进行高通量检测。
[0007]本申请就是在此基础上，创设性的通过LC
‑
MS/MS技术开展鱼类色素代谢物的靶向
代谢组学的定量检测分析，通过对其样品代谢物提取方法、色谱分析方法和质谱分析方法的筛选，建立对其16种代谢物的MRM方法，满足16种代谢物同时定量检测的靶向代谢组检测要求。

技术实现思路

[0008]本专利技术要解决的技术问题是提供基于LC
‑
MS/MS检测方法对鱼类色素代谢物的绝对定量分析方法，使其通过对其样品代谢物提取方法、色谱分析方法和质谱分析方法的筛选，建立对其16种代谢物的MRM方法，满足16种代谢物同时定量检测的靶向代谢组检测要求，从而克服现有的对鱼类色素代谢物检测的空白。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于LC
‑
MS/MS检测方法对鱼类色素代谢物的绝对定量分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
[0010](1)代谢物提取：取鱼类血液或皮肤组织样本100μL，加入100
‑
300μL预冷水和600
‑
800μL预冷的50％异丙醇
‑
乙腈溶液，冰浴超声40
‑
80min，
‑
20℃孵育40
‑
80min沉淀蛋白，16000g 4℃离心15
‑
25min，取上清液，加入内标物L
‑
Glutamate_D5，真空干燥，得鱼类色素代谢物样本；
[0011](2)色谱分离：取步骤(1)得到的鱼类色素代谢物样本，加入100μL50％乙腈
‑
水溶液复溶，16000g 4℃离心15
‑
25min，取上清液为进样样品；
[0012]高效液相色谱条件为：采用Shimadzu Nexera X2 LC
‑
30AD高效液相色谱柱，柱温40℃，流速200μL/min，进样量5μL，流动相是：A液为0.1％甲酸
‑
水溶液，B液为50％异丙醇
‑
乙腈溶液，流动相A液和B液梯度条件为：0
‑
0.5min，B液维持在2％；0.5
‑
4min，B液从2％线性变化到60％；4
‑
8min，B液从60％线性变化到98％；8
‑
9.9min，B液维持在98％；9.9
‑
10min，B液从98％线性变化到5％；10.1
‑
12min，B液维持在5％；
[0013](3)质谱分析：经高效液相色谱分离后的样本进入质谱仪，在质谱仪正/负离子模式下进行质谱分析，采用MRM模式检测待测离子对,完成所述鱼类色素代谢物样本中16种代谢物的定量测定；
[0014]质谱仪参数条件为：ESI源参数为：正离子模式：Source Temperature 500
‑
600℃,Ion Source Gas1:40
‑
50,Ion Source Gas2:40
‑
50,Curtain Gas:20
‑
40,Ion Spray Voltage Floating:3000
‑
6000V；负离子模式：Source Temperature 500
‑
600℃,Ion Source Gas1:40
‑
50，Ion Source Gas2:40
‑
50，Curtain Gas:20
‑
40，Ion Spray Voltage Floating:
‑
2000
‑‑
5500V。
[0015]进一步改进，所述步骤(1)具体为：取鱼类血液或皮肤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LC
‑
MS/MS检测方法对鱼类色素代谢物的绝对定量分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)代谢物提取：取鱼类血液或皮肤组织样本100μL，加入100
‑
300μL预冷水和600
‑
800μL预冷的50％异丙醇
‑
乙腈溶液，冰浴超声40
‑
80min，
‑
20℃孵育40
‑
80min沉淀蛋白，16000g 4℃离心15
‑
25min，取上清液，加入内标物L
‑
Glutamate_D5，真空干燥，得鱼类色素代谢物样本；(2)色谱分离：取步骤(1)得到的鱼类色素代谢物样本，加入100μL50％乙腈
‑
水溶液复溶，16000g 4℃离心15
‑
25min，取上清液为进样样品；高效液相色谱条件为：采用Shimadzu Nexera X2 LC
‑
30AD高效液相色谱柱，柱温40℃，流速200μL/min，进样量5μL，流动相是：A液为0.1％甲酸
‑
水溶液，B液为50％异丙醇
‑
乙腈溶液，流动相A液和B液梯度条件为：0
‑
0.5min，B液维持在2％；0.5
‑
4min，B液从2％线性变化到60％；4
‑
8min，B液从60％线性变化到98％；8
‑
9.9min，B液维持在98％；9.9
‑
10min，B液从98％线性变化到5％；10.1
‑
12min，B液维持在5％；(3)质谱分析：经高效液相色谱分离后的样本进入质谱仪，在质谱仪正/负离子模式下进行质谱分析，采用MRM模式检测待测离子对,完成所述鱼类色素代谢物样本中16种代谢物的定量测定；质谱仪参数条件为：ESI源参数为：正离子模式：Source Temperature500
‑
600℃,Ion Source Gas1:40
‑
50,Ion Source Gas2:40
‑
50,Curtain Gas:20
‑
40,Ion Spray Voltage Floating:3000
‑
6000V；负离子模式：Source Temperature 500
‑
600℃,Ion Source Gas1:40
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽丽，朱华，张蓉，王晓雯，李绘娟，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：