一种基于RPA-LFD技术的小普林藻检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术设计了适于对小普林藻的特定特征序列进行RPA法扩增的引物和方法，并结合LFD技术，对水样中的小普林藻进行检测。使用本发明专利技术的试剂盒和方法，只需要带着恒温装置即可在地进行水样的小普林藻检测，检测时间控制在20min内，检测费时短，无需PCR仪、电泳仪以及凝胶成像系统等复杂设备。此外，本发明专利技术的方法特异性好，灵敏度远高于传统PCR，基因组最低检测限可达到1.5

【技术实现步骤摘要】
一种基于RPA
‑
LFD技术的小普林藻检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于水环境保护领域，更特别地，涉及一种基于RPA
‑
LFD技术的小普林藻检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]小普林藻 (Prymnesium parvum)属于定鞭金藻门(Haptophyta)，颗石藻纲 (Coccolithophyceae)，定鞭金藻目(Prymnesiales)，定鞭藻科(Prymnesiaceae)，普林藻属(Prymnesium)，于1930年在丹麦水域首次发现并被记录，为全球广布种，常在我国各个地区的沿海(大连、天津等)和内陆淡咸水水体(陕西、宁夏等)频繁发生藻华，经研究认证其为海洋起源，如何侵入淡水水体尚不可知。因此，早期检测出水体中的小普林藻，制定藻华预防策略，对防止目标水域中发生小普林藻藻华至关重要。
[0003]目前，用于小普林藻检测的方法主要分为传统的镜检法以及分子生物学方法。传统的镜检法费时费力，且需要经验丰富的专家才能进行较为准确的鉴定，在各类检测方法中并无优势。采用PCR和分子探针等分子检测技术虽具有快速、灵敏等优点，但其对实验设备的要求过高，且需要专业人员进行检测，无法实现有害藻类的野外快速检测这一目标。
[0004]重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA) 需要的仪器简单，耗时短，但是并非任何序列都适用于使用RPA法扩增，因此，需要找到合适的特征序列，设计合适的引物来进行RPA法扩增。

技术实现思路

[0005]为解决以上问题，本专利技术提供了一种检测水样中小普林藻的方法，包括以下步骤：
[0006]S1：提取所述水样中的DNA；
[0007]S2：通过重组酶聚合酶扩增法扩增特征位点，得到RPA扩增产物，所述特征位点的序列如SEQ ID NO:4所示；
[0008]S3：检测所述RPA扩增产物。
[0009]在一个具体实施方案中，S2中，扩增所述特征位点所用的引物序列如 SEQ ID NO:12和13所示。
[0010]在一个具体实施方案中，S2中，扩增温度为39℃，扩增时间为15min。
[0011]在一个具体实施方案中，S3中，通过横向流动测试法检测所述RPA扩增产物。
[0012]在一个具体实施方案中，在S2中扩增体系中加入了带有标签的探针， S3中使用固定了能够捕获所述标签的物质的横向流动试纸条检测所述RPA 扩增产物。
[0013]在一个具体实施方案中，所述探针的序列如SEQ ID NO:16所示，所述标签为羧基荧光素。
[0014]本专利技术还提供了一种用于检测小普林藻的试剂盒，包括扩增用试剂和显示用试剂，所述扩增用试剂包括用于扩增特征位点的引物组，以及与扩增产物结合探针，所述特征位点的序列如SEQ ID NO:4所示，所述探针上设置有标签，所述扩增用试剂为用于重组酶聚
合酶扩增法的试剂；
[0015]所述显示用试剂包括能够捕获所述标签的横向流动试纸条。
[0016]在一个具体实施方案中，所述引物组的引物的序列如SEQ ID NO:12和 13所示。
[0017]在一个具体实施方案中，所述探针的序列如SEQ ID NO:16所示，所述标签为羧基荧光素。
[0018]本专利技术通过大量实验和研究，对比小普林藻与相似藻种的全基因组序列，从大量的具有适度变异性的保守序列中找到了可用于将小普林藻与其他藻种区分开的特征序列。在大量实验筛选后，发现某一特征序列适合使用RPA 法扩增。在此基础上，我们设计了适于对该特征序列进行RPA法扩增的引物和方法，并结合LFD技术，对水样中的小普林藻进行检测。使用本专利技术的试剂盒和方法，只需要带着恒温装置即可在地进行水样的小普林藻检测，检测时间控制在20min内，检测费时短，无需PCR仪、电泳仪以及凝胶成像系统等复杂设备。此外，本专利技术的方法特异性好，灵敏度远高于传统PCR，基因组最低检测限可达到1.5
×
10
‑1pg/μL，模拟样本最低检测限可达到1.12
ꢀ×
10
‑1细胞/mL，为水体有害藻类监测提供了新的工具。
附图说明
[0019]图1为引物组1
‑
5使用RPA法扩增相应的特征片段的电泳照片，其中，泳道1，3，5，7，9分别为引物组1(扩增长度242bp)，引物组2(扩增长度114bp)，引物组3(扩增长度173bp)，引物组4(扩增长度228bp)，引物组5(扩增长度157bp)，泳道2，4，6，8，10为阴性对照。
[0020]图2为PCR，RPA，RPA
‑
LFD的特异性的实验照片，其中，A、B、C分别为PCR、RPA、RPA
‑
LFD三种不同检测方法。泳道M为DL 5000 DNA Marker，泳道NC为空白对照(以超纯水作为模板)，1
‑
9泳道依次为小普林藻，假微型海链藻，柔弱角毛藻，三角褐指藻，多列拟菱形藻，束毛藻，中肋骨条藻，圆海链藻，拟旋链角毛藻。
[0021]图3为PCR，RPA，RPA
‑
LFD的灵敏度的实验照片，其中，A、B、C分别为PCR、RPA、RPA
‑
LFD三种不同检测方法。泳道M为DL 5000 DNA Marker，泳道NC为空白对照(以超纯水作为模板)，1
‑
9泳道依次为1.5
×
104pg/ μL
‑
1.5
×
10
‑3pg/μL浓度的基因组DNA。
[0022]图4为PCR，RPA，RPA
‑
LFD检测模拟野外样品基因组DNA的灵敏度照片，其中，A、B、C分别为PCR、RPA、RPA
‑
LFD三种不同检测方法。泳道M为DL 2000 DNA Marker，泳道NC为空白对照(以超纯水作为模板)，1
‑
9泳道依次为1.12
×
105细胞/mL
‑
1.12
×
10
‑2细胞/mL小普林藻细胞浓度的模拟样本
具体实施方式
[0023]以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0024]1.特征序列和引物的确定
[0025]为了能够灵敏并特异地检测到水体中的小普林藻，我们使用重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，只需要在35
‑
39℃下反应10
‑
15min即可实现高倍数的特异性DNA扩增。
[0026]为了实现上述技术目的，我们对小普林藻的全基因组进行分析，并将其与近似藻种的基因组进行比对，找到了小普林藻基因组中的5处特征位点(序列分别如SEQ ID NO:1
‑
5所示)，针对上述特征位本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测水样中小普林藻的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：提取所述水样中的DNA；S2：通过重组酶聚合酶扩增法扩增特征位点，得到RPA扩增产物，所述特征位点的序列如SEQ ID NO:4所示；S3：检测所述RPA扩增产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中，扩增所述特征位点所用的引物序列如SEQ ID NO:12和13所示。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中，扩增温度为39℃，扩增时间为15min。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S3中，通过横向流动测试法检测所述RPA扩增产物。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在S2中扩增体系中加入了带有标签的探针，S3中使用固定了能够捕获所述标签的物质的横向流动试纸条检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄海龙，姜海波，罗宁建，王鑫威，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：