一种香蕉灰纹病菌的PCR检测引物及检测方法技术

本发明专利技术提供一种香蕉灰纹病菌的PCR检测引物及检测方法，所述PCR检测引物中的上游引物序列为ATGTGCAAGGCCGGTTTCG，下游引物序列为CGTCACATCGGCTCAAATCG。基于该特异性引物，开发出香蕉灰纹病菌的PCR检测方法。利用该引物和检测方法快速检测香蕉灰纹病菌，一次PCR反应结合测序分析即可区分病原物，克服常规鉴定方法的不足，具有特异性强，准确性高、灵敏度高、适用性广及操作简便等优点。适用性广及操作简便等优点。适用性广及操作简便等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种香蕉灰纹病菌的PCR检测引物及检测方法


[0001]本专利技术涉及农作物真菌病害检测
，具体涉及一种香蕉灰纹病菌的PCR检测引物及检测方法。

技术介绍

[0002]香蕉(Musa spp.)是热带、亚热带地区重要的草本果树与粮食作物。随着香蕉生产的规模化和集约化程度的提高，病害发生也日趋严重，已对香蕉产量和品质造成严重影响。香蕉灰纹病(Cordana leaf spot of banana)，又称香蕉暗双孢霉叶斑病，主要危害香蕉叶片，在世界香蕉产区普遍发生。发病初期在叶片正面产生水渍状，近圆形或不规则浅褐色病斑扩大后病斑呈椭圆形或梭形，中央呈浅灰色，有同心轮纹，边缘深褐色，病健交界处有黄色晕圈；严重时病斑沿叶缘扩大汇合成与中脉平行的大斑，叶缘呈波浪纹干枯，外围具亮黄色晕圈；田间湿度大时，叶片背面病斑灰褐色，并产生灰色霉状物，即病原菌的分生孢子梗和分生孢子。生产上该病常和香蕉褐缘灰斑病、煤纹病、新月弯孢叶斑病、棒孢叶斑病混合发生，严重时可致全叶干枯，植株早衰，果实产量与品质降低。近年来香蕉灰纹病在我国香蕉产区普遍发生且为害日益严重，已成为我国香蕉产区常见且危害严重的病害之一，因此开展香蕉灰纹病菌病原菌的快速检测，对该病害的早期诊断和及时有效防治具有十分重要的意义。
[0003]香蕉灰纹病病菌(Neocordana musae(Zimm.)Hern.
‑
Restr.&Crous，异名：Cordana muase Zimm.)在PDA、PSA、OA等常见培养基上生长缓慢，分离时菌落易被杂菌覆盖，而且分生孢子产生时间晚，早期难以鉴别。另外，基于症状为基础的病害常规诊断技术，需经柯赫氏法则如病原菌分离培养、形态学特征观察、致病性试验及症状分析等步骤，耗时较长，且其准确性和可靠性在很大程度上决定于鉴定者的经验和分类学知识掌握程度；其次，该病还常与其他香蕉叶部病害混合发生，导致很难做到病害初发时及时检测和有效控制病害的传播扩散，难以满足香蕉灰纹病诊断的实际需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度较高的快速诊断技术。
[0004]近年来，随着现代分子生物技术的快速发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，其中PCR(polymerase chain reaction)技术以其可快速、特异、灵敏的检测鉴定纯培养菌株和带菌样本的特点受到关注，被广泛应用于植物病原菌的检测。目前国内外研究人员已成功开发出香蕉褐缘灰斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉黑星病菌、香蕉冠腐病菌等多种香蕉病原菌的特异性引物和检测方法，实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关香蕉灰纹病菌分子检测的研究尚未见报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术对香蕉灰纹病菌的检测和鉴定主要基于病原菌的形态学特征，但因香蕉灰纹病菌生长较缓慢，产孢迟，分离程序繁琐、耗时长、且其准确性和可靠性在很大程度上决定于鉴定者的经验和分类学知识，难以满足香蕉灰纹病诊断的实际需要问题，本发
明提供一种专用于香蕉灰纹病病原菌的PCR检测引物及检测方法，实现田间香蕉灰纹病的快速、灵敏和准确的鉴定。
[0006]本专利技术技术方案主要包括以下内容：
[0007]一种香蕉灰纹病菌Neocordana musae的PCR检测引物NMF/NMR2，上游引物序列为ATGTGCAAGGCCGGTTTCG，下游引物序列为CGTCACATCGGCTCAAATCG。
[0008]本专利技术涉及所述的PCR检测引物NMF/NMR2在检测香蕉灰纹病菌中的应用。
[0009]基于上述特异性检测引物NMF/NMR2，本专利技术进一步提供一种香蕉灰纹病菌的PCR检测方法，包括以下步骤：
[0010](1)提取待检样品基因组DNA；
[0011](2)以提取的待检样品基因组DNA为模板，以NMF/NMR2为引物，进行PCR扩增；
[0012](3)取PCR扩增产物进行电泳分析，根据扩增产物的大小判定检测结果；如果能特异性地扩增出268bp的产物，即可判定样品中携带香蕉灰纹病菌，否则样品中不存在香蕉灰纹病菌。
[0013]优选的，所述PCR扩增的退火温度为55℃。
[0014]优选的，所述待检样品基因组DNA包括病菌的基因组DNA或香蕉叶片基因组DNA。
[0015]优选的，PCR反应体系为：12.5μL Premix Taq，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，DNA模板1μL，补ddH2O至25μL。
[0016]优选的，PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，共30个循环；72℃延伸5min；10℃保存。
[0017]与现有技术相比，本专利技术所取得的显著效果：
[0018](1)特异性强：本专利技术所设计的引物NMF/NMR2对香蕉灰纹病菌具有很强的特异性，能够用于区别香蕉煤纹病菌、香蕉褐缘灰斑病菌、香蕉黑星病菌、香蕉新月弯孢、香蕉链格孢菌、香蕉梨孢菌、香蕉炭疽菌、香蕉棒孢菌、香蕉枯萎病菌等香蕉上常见的病原菌，从而能有效区分发生在香蕉上症状相似的病害。
[0019](2)准确性高：本专利技术采用对香蕉灰纹病菌具有特异扩增作用的PCR引物NMF/NMR2，对香蕉灰纹病菌、为害香蕉的其他病原菌、香蕉灰纹病典型症状香蕉叶片、人工接种香蕉叶片、香蕉灰纹病与其他香蕉叶部病害混合浸染的香蕉叶片及健康香蕉叶片进行了检测验证，只有香蕉灰纹病菌和携带该病原菌的香蕉叶片组织能特异性地扩增出一条268bp的电泳条带，说明本专利技术所设计的引物NMF/NMR2与检测方法用于检测香蕉灰纹病菌准确可靠。
[0020](3)灵敏度高：本专利技术将设计的特异引物NMF/NMR2进行PCR扩增后，对香蕉灰纹病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达20pg/μL。
[0021](4)适用性广：本专利技术的香蕉灰纹病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的香蕉叶片进行检测，可实现香蕉灰纹病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，对监测与预防香蕉生长期灰纹病的爆发流行有重要意义。
[0022](5)操作简便：本专利技术只需进行DNA提取、PCR扩增、琼脂糖电泳及扩增产物测序分析后即可判定结果，一般整个检测过程可在数小时内完成，操作简便快捷。
附图说明
[0023]图1：部分参试样品基因组DNA 1％琼脂糖凝胶电泳图。泳道M为Marker DL 5 000，泳道1
‑
5为香蕉基因组DNA，泳道6
‑
11为香蕉灰纹病菌基因组DNA。
[0024]图2：候选引物对香蕉灰纹病菌的有效性测试电泳图。A
‑
D分别为NMF/NMR1、NMF/NMR2、NMF/NMR3、NMF/NMR4，泳道M为Marker DL2 000；泳道1
‑
3为香蕉灰纹病菌，泳道4为阴性对照。
[0025]图3：候选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种香蕉灰纹病菌Neocordana musae的PCR检测引物NMF/NMR2，其特征在于，上游引物序列为ATGTGCAAGGCCGGTTTCG，下游引物序列为CGTCACATCGGCTCAAATCG。2.一种香蕉灰纹病菌的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待检样品基因组DNA；(2)以提取的待检样品基因组DNA为模板，以权利要求1所述NMF/NMR2为引物，进行PCR扩增；(3)取PCR扩增产物进行电泳分析，根据扩增产物的大小判定检测结果；如果能特异性地扩增出268bp的产物，即可判定样品中携带香蕉灰纹病菌，否则样品中不存在香蕉灰纹病菌。3.如权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的退火温度为55℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：漆艳香，张欣，谢艺贤，彭军，曾凡云，喻群芳，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：