抗氰氟草酯千金子的PCR检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了用于检测抗氰氟草酯千金子的特异性引物对，包含上述引物对的PCR检试剂盒以及抗氰氟草酯千金子的PCR检测方法。本发明专利技术的引物对能够将千金子的两个ACCase基因扩增出来，扩增序列包含已报道的7个抗性相关位点，经过生物测定试验验证，可准确检测出抗氰氟草酯的千金子。本发明专利技术操作简便，检测快速，从取样提取DNA到鉴定结果仅需2

【技术实现步骤摘要】
抗氰氟草酯千金子的PCR检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于抗除草剂杂草检测
，具体涉及一种抗氰氟草酯千金子的PCR检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]千金子（Leptochloa chinensis (L.) Nees）是我国稻田常见的禾本科杂草之一，随着我国稻田免耕、直播技术的发展，千金子危害日益严重，目前已成为中国直播稻田的优势杂草，严重威胁水稻的产量和品质。有研究表明，当稻田千金子发生密度为21株/
㎡
时，可造成早、中、晚稻产量分别降低达39.22%、44.36%和37.8%。氰氟草酯是我国水稻田应用最为广泛的乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）抑制剂，防除水稻田一年生禾本科杂草，尤其对千金子防治效果突出。氰氟草酯连续多年的使用，导致千金子对氰氟草酯抗药性的快速发展。在我国江苏、安徽、湖南、浙江等省份都发现了高抗千金子种群，在生产中以常规剂量甚至加倍剂量的氰氟草酯已经无法有效防除抗性千金子。
[0003]抗性千金子的出现，使得氰氟草酯对此杂草失去了防效，且使同一作用机理的除草剂噁唑酰草胺和精噁唑禾草灵对抗性千金子的防效也大打折扣，而在生产实践中由于农户对杂草抗药性认识不足，盲目增加除草剂用量，不仅增加了用药成本，还影响了水稻产量。因此，迫切需要一个可以快速简便检测千金子对氰氟草酯抗药性的方法。
[0004]据了解，氰氟草酯的作用靶标为植物体内的乙酰辅酶A羧化酶，通过抑制质体中ACCase的活性从而影响植物体内正常的脂肪酸合成，进而导致植物死亡。千金子对氰氟草酯产生抗药性的主要原因是ACCase基因发生点突变，导致除草剂与靶标结合受阻或减弱，从而降低除草剂效果。目前传统的杂草抗药性检测方法主要是整株生物测定法，也称盆栽法。该方法需要采集敏感和疑似抗性杂草的种子，在室内培养到一定阶段后，喷施不同剂量的除草剂，最后调查杂草的鲜重或存活率，计算出抗性倍数。整株生物测定法检测杂草抗药性所需时间长，工作量大且不能对当季杂草进行及时检测。随着分子生物学技术的快速发展和其在杂草抗药性机理研究方面的广泛应用，虽然杂草对ACCase抑制剂类除草剂的靶标抗性机理已经明确，但是目前尚未发现关于抗氰氟草酯千金子PCR检测方法的报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种抗氰氟草酯千金子的PCR检测方法及试剂盒，通过PCR扩增靶标酶ACCase基因并对其进行测序，检测ACCase基因上抗性相关位点是否发生突变，从而鉴定杂草是否对除草剂产生抗药性。
[0006]本专利技术的目的之一是提供一种抗氰氟草酯千金子的PCR检测方法。
[0007]本专利技术的目的之二是提供一种用于检测抗氰氟草酯千金子的试剂盒。
[0008]为实现本专利技术的目的，具体采用如下的技术方案：本专利技术首先提供用于检测抗氰氟草酯千金子的特异性PCR引物对，包括用于特异性扩增千金子ACCase基因的引物对，引物序列如下：
正向引物LcACCase
‑
F: 5
’‑
TTGCTTCCGTGTTGGTTG
‑3’
反向引物LcACCase
‑
R: 5
’‑
GGTCAAGCCTACCCATACA
‑3’
其中，ACCase基因的GeneBank登录号为MW266986 和MW266987。
[0009]本专利技术通过克隆获得千金子的两个ACCase基因部分序列（GeneBank登录号：MW266986 和MW266987）。根据千金子ACCase基因序列，设计一对特异性引物LcACCase
‑
F/LcACCase
‑
R，可扩增出两个千金子ACCase基因，用于检测抗氰氟草酯千金子。
[0010]本专利技术还提供含有上述引物的可用于检测抗氰氟草酯千金子的试剂盒。
[0011]本专利技术所述试剂盒中还包括2
×
Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs和标准阳性模板。
[0012]本专利技术还提供一种抗氰氟草酯千金子的PCR检测方法，利用上述引物对或上述试剂盒检测抗氰氟草酯千金子。
[0013]所述的PCR检测方法，包括以下步骤：1）提取待检测千金子植株的DNA；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，进行PCR反应；3）对步骤2）PCR反应后的产物进行电泳，条带回收并测序分析。
[0014]PCR反应体系以40
ꢀµ
L计为：2
×
Taq DNA聚合酶，20
ꢀµ
L；10
ꢀµ
M的LcACCase
‑
F，1
ꢀµ
L；10
ꢀµ
M的LcACCase
‑
R，1
µ
L；2.5mM的dNTPs，2
µ
L；PCR反应缓冲液，4
ꢀµ
L；DNA模板，1
ꢀµ
L；；dd H2O，11
ꢀµ
L。
[0015]PCR反应条件为：94 ℃ 10 min； 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，34个循环；72 ℃ 5 min。
[0016]本专利技术涉及用于检测康氰氟草酯千金子的特异性引物对与PCR检测试剂盒。本专利技术的引物对能够将千金子的两个ACCase基因扩增出来，扩增序列包含已报道的7个抗性相关位点，经过生物测定试验验证，可准确检测出抗氰氟草酯的千金子。本专利技术的方法采用分子生物学技术对靶标基因进行快速检测和分析，从采集样本到鉴定结果只需2
‑
4天，对于当季发生的千金子抗性也可进行检测，且检测原理是基于靶标基因核苷酸突变，该方法具有快速和准确率高的特点。
[0017]本专利技术操作简便，检测快速，从取样提取DNA到鉴定结果仅需2
‑
4天，从而指导水稻田中抗性千金子的科学防治。
附图说明
[0018]图1为本专利技术中引物LcACCase
‑
F/LcACCase
‑
R扩增千金子ACCase基因电泳结果示意图。
[0019]图2 为本专利技术中利用引物LcACCase
‑
F/LcACCase
‑
R扩增千金子ACCase基因的PCR产物测序结果示意图，图中重叠峰表明扩增出两个ACCase基因。
[0020]图3为本专利技术实例2中利用引物LcACCase
‑
F/LcACCase
‑
R扩增抗性千金子PCR产物测序结果示意图，其中ACCase基因的1999位由TGG突变成TGC。
[0021]图4为本专利技术实例2中利用引物LcACCase
‑
F/LcACCase
‑
R扩增抗性千金子PCR产物测序结果示意图，其中ACCase基因的2027位由TGG突变成TGC。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测抗氰氟草酯千金子的特异性PCR引物对，其特征在，包括用于特异性扩增千金子ACCase基因的引物对，其序列如下：正向引物LcACCase
‑
F: 5
’‑
TTGCTTCCGTGTTGGTTG
‑3’
反向引物LcACCase
‑
R: 5
’‑
GGTCAAGCCTACCCATACA
‑3’
。2.含有权利要求1所述引物对的用于检测抗氰氟草酯千金子的试剂盒。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2
×
Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs和标准阳性模板。4.抗氰氟草酯千金子的PCR检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述引物对或权利要求2
‑
3任一项所述试剂盒检测抗氰氟草酯千金子。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）提取待检测千金子植株的DNA；2）以步骤1）中提取的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓维，李扬，段志文，冯建国，袁树忠，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：