热稳定性提高的重组hLIF突变体及其制备方法和应用技术

本申请公开了一种热稳定性提高的重组hLIF突变体及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。该重组hLIF突变体是基于能量与进化的方法在野生型hLIF上发生的点突变，包括在野生型hLIF的65位苏氨酸突变成谷氨酰胺(T65Q)、119位的丙氨酸突变为亮氨酸(A119L)，127位的丝氨酸突变为异亮氨酸(S127I)中一种或多种点突变，重组hLIF突变体具有生物学活性，热稳定性提高且生物活性半衰期变长。同时，将重组hLIF突变体与TrxA融合表达，制备热稳定性提高的具有生物学活性的重组TrxA

【技术实现步骤摘要】
热稳定性提高的重组hLIF突变体及其制备方法和应用


[0001]本申请属于生物医药
，具体涉及热稳定性提高的重组hLIF突变体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor，LIF)是一种多效细胞因子，属于IL
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6亚家族。LIF可以与IL
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6亚家族的共同受体gp130结合，再结合自身的受体LIF受体形成三元复合物。LIF的功能包括促进原始生殖细胞的增殖，调节囊胚着床和早期妊娠，维持胚胎干细胞的多能性。LIF为180个氨基酸组成的多肽，其核心蛋白分子量为20kDa，共有7个糖基化位点，6个半胱氨酸，分子内部二硫键对于维持LIF分子的结构和生物学活性可能起着重要作用。人源LIF(hLIF)和小鼠、猪等动物源LIF在氨基酸水平上具有较高的同源性且hLIF对小鼠、猪等动物细胞都具有一定的活性。但是野生型LIF的热稳定性低、半衰期短，对于培养干细胞(SC)在内的多种细胞并不适用。因此，如何提高LIF的热力学稳定性和生物活性半衰期，在细胞体外培养等应用中特别重要。
[0003]现有技术中LIF的制备，通常以大肠杆菌为宿主进行重组LIF的表达，但是LIF含有三对二硫键，在以大肠杆菌为宿主表达时极易形成包涵体。因此，常常利用硫氧还蛋白(TrxA)与LIF融合表达，TrxA具有催化蛋白质二硫键还原的功能，可以帮助蛋白质正确折叠，增加外源蛋白的可溶性。

技术实现思路

[0004]1.要解决的问题
>[0005]针对现有技术中hLIF热稳定性低、生物活性半衰期短等问题之一，本申请提供了一种重组hLIF突变体，该重组hLIF突变体是基于能量与进化的方法在野生型hLIF上发生的点突变，包括在野生型hLIF的65位苏氨酸突变成谷氨酰胺(T65Q)、119位的丙氨酸突变为亮氨酸(A119L)，127位的丝氨酸突变为异亮氨酸(S127I)中一种或多种点突变，重组hLIF突变体具有生物学活性，热稳定性提高且生物活性半衰期变长。同时，将重组hLIF突变体与TrxA融合表达，制备热稳定性提高的具有生物学活性的重组hLIF突变体或TrxA
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hLIF突变体的融合蛋白，可用于细胞生物学研究、医药等领域。
[0006]2.技术方案
[0007]为了解决上述问题，本申请所采用的技术方案如下：
[0008]本申请提供了一种重组hLIF突变体，该重组hLIF突变体包括在野生型hLIF的65位苏氨酸突变成谷氨酰胺(T65Q)、119位的丙氨酸突变为亮氨酸(A119L)，127位的丝氨酸突变为异亮氨酸(S127I)中一种或多种点突变，上述点突变是基于能量与进化的方法在野生型hLIF上发生的点突变，提高了hLIF热稳定性。
[0009]进一步地，上述野生型hLIF的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]进一步地，上述一种重组hLIF突变体是野生型hLIF的65位苏氨酸突变成谷氨酰胺
(T65Q)，命名为hLIF突变体M1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]进一步地，上述一种重组hLIF突变体是野生型hLIF的119位丙氨酸突变为亮氨酸(A119L)，命名为hLIF突变体M2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]进一步地，上述一种重组hLIF突变体是野生型hLIF的127位的丝氨酸突变为异亮氨酸(S127I)，命名为hLIF突变体M3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]进一步地，上述一种重组hLIF突变体是野生型hLIF的65位苏氨酸突变成谷氨酰胺(T65Q)，且119位的丙氨酸突变为亮氨酸(A119L)，命名为hLIF突变体M4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0014]进一步地，上述一种重组hLIF突变体是野生型hLIF的65位苏氨酸突变成谷氨酰胺(T65Q)、119位的丙氨酸突变为亮氨酸(A119L)，127位的丝氨酸突变为异亮氨酸(S127I)，命名为hLIF突变体M5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0015]本申请还提供了一种融合蛋白TrxA
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hLIF突变体，包括TrxA和上述任一的重组hLIF突变体，融合蛋白TrxA
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hLIF突变体与融合蛋白TrxA
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hLIF野生型相比，其Tm值提高，且具有生物学活性，热稳定性得到提高。
[0016]本申请还提供了一种编码上述重组hLIF突变体的核酸分子，本领域人员知晓由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本专利技术所述的hLIF的突变体的核苷酸序列。
[0017]进一步地，上述编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0018]进一步地，上述编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0019]进一步地，上述编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0020]进一步地，上述编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0021]进一步地，上述编码SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
[0022]进一步地，上述编码SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0023]本申请还提供了上述融合蛋白TrxA
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hLIF野生型或突变体的制备方法，包括：将上述编码重组hLIF野生型或重组hLIF突变体的核酸分子和编码TrxA的核酸分子连接并克隆至质粒，将质粒导入大肠杆菌SHuffle T7中得到含有编码TrxA
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hLIF野生型或TrxA
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hLIF突变体重组质粒的大肠杆菌菌株SHuffle T7，利用IPTG诱导表达，最后提取并纯化获得融合蛋白TrxA
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hLIF野生型与突变体，SHuffle T7是K12的衍生菌株，该菌株染色体中整合了一个二硫键异构酶DsbC基因，可以促进含有二硫键蛋白的正确折叠。
[0024]进一步地，上述质粒包括pET32a等。
[0025]进一步地，上述利用IPTG诱导表达包括：将含有编码TrxA
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hLIF野生型或TrxA
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hLIF突变体重组质粒的大肠杆菌菌株SHuffle T7培养至OD
600
大约在0.6～0.8，将培养物冷却至18℃，180r/min下用终浓度为0.5mM的IPTG诱导16h。
[0026]本申请还提供了上述融合蛋白TrxA
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hLIF突变体在细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组hLIF突变体，其特征在于，所述重组hLIF突变体包括在野生型hLIF的65位苏氨酸突变成谷氨酰胺(T65Q)、119位的丙氨酸突变为亮氨酸(A119L)，127位的丝氨酸突变为异亮氨酸(S127I)中一种或多种点突变，所述野生型hLIF的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种重组hLIF突变体，其特征在于，所述重组hLIF突变体是野生型hLIF的65位苏氨酸突变成谷氨酰胺(T65Q)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的一种重组hLIF突变体，其特征在于，所述重组hLIF突变体是野生型hLIF的119位的丙氨酸突变为亮氨酸(A119L)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1所述的一种重组hLIF突变体，其特征在于，所述重组hLIF突变体是野生型hLIF的127位的丝氨酸突变为异亮氨酸(S127I)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。5.根据权利要求1所述的一种重组hLIF突变体，其特征在于，所述重组hLIF突变体是野生型hLIF的65位苏氨酸突变成谷氨酰胺(T65Q)，且119位的丙氨酸突变为亮氨酸(A119L)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。6.根据权利要求1所述的一种重组hLIF突变体，其特征在于，所述重组hLIF突变体是野生型hLIF的65位苏氨酸突变成谷氨酰胺(T65Q)、119位的丙氨酸突变为亮氨酸(A119L)，127位的丝氨酸突变为异亮氨酸(S127I)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。7.一种融合蛋白TrxA
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵翔，丁赛赛，岳冰，
申请(专利权)人：南京周子未来食品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：