一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法、干细胞系和应用技术

本发明专利技术公开了一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法、干细胞系和应用，属于细胞培养技术领域。该驯化方法是将猪肌肉干细胞依次进行2D贴壁生长、3D微载体贴壁悬浮培养、3D微载体贴壁悬浮放大培养和无载体无血清悬浮培养，得到适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞系，并利用上述方法驯化猪永生化肌肉干细胞YP

【技术实现步骤摘要】
一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法、干细胞系和应用


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法、干细胞系和应用。

技术介绍

[0002]细胞培养肉，是指利用细胞培养技术，在体外培养动物肌肉干细胞并通过分化形成肌肉组织，并将其加工为食用的肉类蛋白，属于一种新兴的未来食品。细胞体外培养主要包括贴壁培养和悬浮培养两种主要方式，相比于贴壁培养，悬浮培养细胞具有明显的优势：悬浮细胞可以在培养基中以悬浮的状态进行生长增殖，细胞密度可达到每毫升数千万个细胞，而且传代方便、易收获细胞。然而，许多细胞由于锚定生长的特性只能贴壁培养，一次性收获的细胞数量受到严重限制。对于商业化培养模式来说，首要的是实现细胞数量的最大化。因此，将贴壁细胞系驯化为悬浮生长的细胞系是非常重要的。
[0003]传统的贴壁培养使用动物血清为细胞贴壁、增殖和分化提供所需的营养成分和生物因子，但血清成分不明确，在提取的血清中可能带入支原体、病毒等，不能满足食品安全的要求。近年的研究表明，无血清培养基对细胞的生长速率、细胞密度、产物及蛋白表达水平可与血清培养基相比，并且可以通过精确控制无血清培养基组分调控细胞的增殖分化节点，其显著的优势将逐步取代含血清细胞培养。
[0004]由于无血清悬浮生长的技术壁垒高，很少有细胞系能轻易地从贴壁生长模式转变为无载体无血清悬浮生长模式。目前，胚胎干细胞已经成功实现悬浮培养、成纤维细胞可实现90％以上的细胞以单细胞无血清悬浮生长、间充质干细胞仍以细胞锚定成团的方式悬浮生长。肌肉干细胞在微载体上悬浮贴壁培养而收获的细胞受限、依赖于血清生长而且不满足细胞培养肉的商业化需求，还没有真正实现无载体无血清悬浮生长。
[0005]因此，迫切需要将肌肉干细胞驯化为适应无载体无血清悬浮生长的干细胞系，放大悬浮培养以扩增足够数量的肌肉干细胞，是实现细胞培养肉商业化生产的重要手段。

技术实现思路

[0006]1.专利技术目的
[0007]本专利技术针对目前肌肉干细胞无载体无血清悬浮培养领域研究的空白，提供了一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法、干细胞系和应用，该驯化方法是将猪肌肉干细胞依次进行2D贴壁生长、3D微载体贴壁悬浮培养、3D微载体贴壁悬浮放大培养和无载体无血清悬浮培养，得到适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞系，并利用上述方法驯化猪肌肉干细胞YP
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S4
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SC获得适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞系幼猪肌肉干细胞株YP
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S4
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S
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SC，该细胞系可在摇瓶、转瓶和反应器中进行无载体无血清悬浮培养，最高细胞密度达在1.5
×
106/ml左右，并稳定增殖8代左右，细胞活率在90％以上，可用于大规模的细胞培养肉制备。
[0008]2.技术方案
[0009]为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0010]本专利技术提供了一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法，驯化后获得的猪肌肉干细胞系能适应无载体无血清悬浮培养，该方法包括如下步骤：
[0011]S1：猪肌肉干细胞2D贴壁生长，猪肌肉干细胞用含15％～20％胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养箱中培养2～3天，换液培养，细胞密度在60～80％进行胰酶消化处理，离心得到细胞沉淀；
[0012]S2：3D微载体贴壁悬浮培养，用含15％～20％胎牛血清的DMEM培养基重悬S1中离心得到细胞沉淀，接种到含有1～5mg/ml微载片、15％～20％胎牛血清的DMEM培养基转瓶中，进行3D微载体贴壁悬浮培养；2～4天后更换50％的新鲜培养基；5～6天后添加终浓度为1～2mg/ml的微载片裂解液(3D Digest溶液)，37℃培养箱中50
±
5rpm裂解20～30min，微载片完全溶解后离心获得细胞沉淀；
[0013]S3：3D微载体贴壁悬浮放大培养，用含15％～20％胎牛血清的完全培养基重悬S2中的细胞沉淀，接种到含有1～5mg/ml微载片、15％～20％胎牛血清的完全培养基的生物反应器中，进行3D微载体贴壁悬浮放大培养；2～4天后更换50％的新鲜培养基；6～7天后去除50％培养基并加入终浓度为1～2mg/ml的微载片裂解液(3D Digest溶液)，微载体完全溶解后离心收获适应贴壁悬浮的细胞；
[0014]S4：无载体无血清悬浮培养驯化，将S3中收获的适应贴壁悬浮的细胞接种到含有0.01％羟丙基甲基纤维素和0.1％抗结团剂的无血清培养基中，悬浮驯化培养，稳定增殖后得到适应无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞系。
[0015]优选地，上述步骤S1中，用含15％胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养箱中培养2天，进行换液，细胞密度在60％进行胰酶消化处理。
[0016]优选地，上述步骤S2中，用含15％胎牛血清的DMEM培养基重悬S1中离心得到细胞沉淀，接种到含有1mg/ml微载片、15％胎牛血清的DMEM培养基转瓶，进行3D微载体贴壁悬浮培养；3天后更换50％的新鲜培养基；5天后添加终浓度为1mg/ml的微载片裂解液(3D Digest溶液)，37℃培养箱中50rpm裂解20～30min，微载片完全溶解后离心获得细胞沉淀。
[0017]优选地，上述步骤S2中，转瓶接种后的细胞密度为(2～10)
×
104个/ml。
[0018]优选地，上述步骤S2中，3D微载体贴壁悬浮培养条件为：37℃培养箱中，磁力搅拌体系控制在转速为40rpm，5min；0rpm，2h；24h后转速调整为50rpm，可以使细胞更好的贴壁在微载体上。
[0019]优选地，上述步骤S3中，用含15％胎牛血清的完全培养基重悬S2中的细胞沉淀，接种到含1mg/ml微载片、15％胎牛血清的完全培养基的生物反应器中，进行3D微载体贴壁悬浮放大培养；3天后更换50％的新鲜培养基；6天后去除50％培养基并加入终浓度为1mg/ml的微载片裂解液(3D Digest溶液)，微载体完全溶解后离心收获适应贴壁悬浮的细胞。
[0020]优选地，上述步骤S4中，无血清培养基中接种后的细胞密度为(2～5)
×
105个/ml。
[0021]优选地，上述步骤S4中悬浮驯化培养条件为：37℃，转速为90～120rpm。
[0022]优选地，上述猪肌肉干细胞为猪肌肉干细胞YP
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S4
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SC，保藏于中国典型培养物保
藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2022256，保藏日为2022年8月6日，该细胞能够自发永生化。
[0023]优选地，上述一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法，猪肌肉干细胞为猪肌肉干细胞YP
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S4
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SC，该方法具体包括如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法，其特征在于，所述驯化方法驯化获得的猪肌肉干细胞系能进行无载体无血清悬浮培养，所述驯化方法包括如下步骤：S1：猪肌肉干细胞2D贴壁生长，猪肌肉干细胞用含15％～20％胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养箱中培养2～3天，换液培养，细胞密度在60～80％进行胰酶消化处理，离心得到细胞沉淀；S2：3D微载体贴壁悬浮培养，用含15％～20％胎牛血清的DMEM培养基重悬S1中离心得到细胞沉淀，接种到含有1～5mg/ml微载片、15％～20％胎牛血清的DMEM培养基转瓶中，进行3D微载体贴壁悬浮培养；2～4天后更换50％的新鲜培养基；5～6天后去除50％培养基并加入终浓度为1～2mg/ml的微载片裂解液，37℃培养箱中50
±
5rpm裂解20～30min，微载片完全溶解后离心获得细胞沉淀；S3：3D微载体贴壁悬浮放大培养，用含15％～20％胎牛血清的完全培养基重悬S2中的细胞沉淀，接种到含有1～5mg/ml微载片、15％～20％胎牛血清的DMEM培养基的生物反应器中，进行3D微载体贴壁悬浮放大培养；2～4天后更换50％的新鲜培养基；6～7天后去除50％培养基并加入终浓度为1～2mg/ml的微载片裂解液，微载体完全溶解后离心收获适应贴壁悬浮的细胞；S4：无载体无血清悬浮培养驯化，将S3中收获的适应贴壁悬浮的细胞接种到含有0.01％羟丙基甲基纤维素和0.1％抗结团剂的无血清培养基中，悬浮驯化培养，稳定增殖后得到适应无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞系。2.根据权利要求1所述的一种适应无载体无血清悬浮培养的猪肌肉干细胞的驯化方法，其特征在于，所述步骤S1中，用含15％胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养箱中培养2天，进行换液，细胞密度在60％进行胰酶消化处理；和/或所述步骤S2中，用含15％胎牛血清的DMEM培养基重悬S1中离心得到细胞沉淀，接种到含有1mg/ml微载片、15％胎牛血清的DMEM培养基转瓶，进行3D微载体贴壁悬浮培养；3天后更换50％的新鲜培养基；5天后添加终浓度为1mg/ml的微载片裂解液，37℃培养箱中50rpm裂解20～30min，微载片完全溶解后离心获得细胞沉淀；和/或所述步骤S3中，用含15％胎牛血清的DMEM重悬S2中的细胞沉淀，接种到含有1mg/ml微载片、15％胎牛血清的完全培养基的生物反应器中，进行3D微载体贴壁悬浮放大培养；3天后更换50％的新鲜培养基；6天后去除50％培养基并加入终浓度为1mg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：周光宏，丁世杰，李惠芳，朱浩哲，潘振鹏，况毅，蔡立飞，
申请(专利权)人：南京周子未来食品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：