α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及酶工程和基因工程领域，具体涉及α

【技术实现步骤摘要】
α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及酶工程和基因工程领域，具体涉及α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]α
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L
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鼠李糖苷酶是一种重要的生物技术酶，可以水解大部分天然产物末端的L
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鼠李糖，例如芦丁、橙皮苷、人参皂苷等。广泛分布于细菌、真菌、植物、动物组织等。应用于工业、药用预处理和食品生产等，例如，它可以使果汁脱苦，通过萜烯的去糖基化来增强葡萄汁和改善葡萄酒香味等。芦丁，来源于槐花，苦荞等植物中，归属于黄酮醇，是槲皮素的二糖糖苷，其具广泛的药理活性，包括抗氧化、降压、抗癌、抗流感和抗炎等作用，异槲皮素同样具备此药理活性，但其因为糖苷的存在，具有可以提高化合物稳定性，增加水溶性，减少毒副作用，提高药物特异性和靶向性等优势，引来了越来越多学者的关注。然而，目前在对α
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L
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鼠李糖苷酶进行大规模工业和食品生产时，仍然存在着大量的技术障碍，由于天然的α
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L
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鼠李糖苷酶活力较低，反应条件不适等因素限制其应用。
[0003]随着蛋白质工程技术的不断兴起，开始对蛋白序列进行修改与编辑，对所需酶进行分子改造，最终达到我们的目的酶。目前，分子改造包括定向进化，理性设计和半理性设计。定向进化是在一个感兴趣的基因中低频率地引入随机分布的突变，然后选择具有所需特性的突变蛋白，定向进化可以使酶实现相对快速的工程，而不需要深入了解结构功能关系，主要限制是必须开发一种高通量筛选方法；与定向进化不同的是，理性设计需要深入的了解所改造酶的序列、结构和功能关系，最终确定所需突变的靶点，进行定点突变来研究其特性；最新进展采用定向进化与理性设计相结合，即半理性设计，来弥补上述缺陷，简单地说，该方法利用蛋白质序列和结构信息，以及相关计算，构建一个更小但智能的突变库来针对特定的残基，对特定氨基酸位置的关注会导致文库大小的显著减少，进而筛选优秀突变体。
[0004]专利号为CN202010653391.2，名称为一种α
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鼠李糖苷酶、其编码基因及其表达和应用，涉及耐高温，热稳定性的α
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鼠李糖苷酶，在适宜条件下可以将芦丁几乎实现完全转化为异槲皮素，催化活力仍是受限，但并未涉及分子改造技术；专利号为CN202110692714.3，名称为一种鼠李糖苷酶突变体及其制备方法和应用，对α
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鼠李糖苷酶进行半理性设计得到高活性的组合突变体，并未应用于大量制备异槲皮素。因此，对α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A进行半理性设计获得具备水解芦丁生成异槲皮素的高效率的α
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L
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鼠李糖苷酶优秀突变体是一个具有意义的研究方向。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体及其制备方法和应用。
[0006]第一方面，本专利技术提供α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体，所述突变体的氨基酸序
列与SEQ ID NO.1所示的BtRha78A酶具有一个氨基酸的突变，所述突变为第44位的苯丙氨酸突变为天冬氨酸或丝氨酸。
[0007]第二方面，本专利技术提供编码所述α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体的DNA分子。
[0008]进一步的，所述DNA分子具有a1
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a3所示核苷酸序列中任意一个：
[0009]a1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
[0010]a2、a1中核苷酸序列的互补序列；
[0011]a3、编码所述α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体，且因遗传密码的简并性而与a1和a2不同的核苷酸序列。
[0012]第三方面，本专利技术提供具有所述DNA分子的重组表达载体。
[0013]第四方面，本专利技术提供包含所述重组表达载体的宿主细胞。
[0014]第五方面，本专利技术提供所述α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体的制备方法，包括以下步骤：诱导所述宿主细胞表达α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体，分离纯化表达的α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体。
[0015]第六方面，本专利技术提供所述α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体在催化芦丁制备异槲皮素中的应用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0017]1.本专利技术利用PyMOL对α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A底物通的入口处的氨基酸进行分析，确定第44为作为突变靶点，对其进行半理性设计新酶，获得了在短时间内催化效率更高的优秀突变体，为实现大量水解芦丁制备异槲皮素进行工业化提供了理论指导。
[0018]2.利用全细胞和纯酶分别对芦丁进行催化反应，突变体在37℃和pH 6.5的体系下进行反应。全细胞条件下，反应时间为60min时，WT的转化率为33.9％，F44S和F44D的转化率比WT分别高出45.8％和33.1％。纯酶条件下，反应时间为20min时，WT转化率仅为10.7％，此时F44S和F44D转化率分别提高2.55倍和1.38倍。
附图说明
[0019]图1为实施例1中底物通道及其入口处的氨基酸残基。
[0020]图2为实施例1中丙氨酸扫描突变体全细胞对芦丁催化的相对活性。
[0021]图3为实施例2中全质粒PCR产物的核酸电泳图。
[0022]图4为实施例2中催化反应的流程图。
[0023]图5为实施例2中芦丁和异槲皮素的标准曲线。
[0024]图6为实施例2中野生型及突变体全细胞对芦丁水解活性评价。
[0025]图7为实施例3中野生型及突变体纯化后目的蛋白SDS
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PAGE。图中的泳道1代表Maker，泳道2
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5分别代表WT、F44A、F44D、F44S纯化后的目的蛋白。
[0026]图8为实施例3中纯酶条件下高活性突变体催化芦丁时间曲线。
[0027]图9为实施例3中纯酶条件下反应时间为20min时优秀突变体对芦丁的催化活性。
具体实施方式
[0028]下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的BtRha78A酶具有一个氨基酸的突变，所述突变为第44位的苯丙氨酸突变为天冬氨酸或丝氨酸。2.编码权利要求1所述α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突变体的DNA分子。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，具有a1
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a3所示核苷酸序列中任意一个：a1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；a2、a1中核苷酸序列的互补序列；a3、编码所述α
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L
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鼠李糖苷酶BtRha78A突...

【专利技术属性】
技术研发人员：李彬春，李雪，侯雪婷，要文静，丁国斌，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：