高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用。本发明专利技术以野生型木聚糖酶Xyn11为基础，提供了包含T21S，A23G，T26D，M29V，Y103T，T109V，E118Q/R，V151S/T，G152D，S183D，S184A中至少一个突变位点的突变体。与野生型木聚糖酶Xyn11相比，所述碱性木聚糖酶突变体的比活力普遍提高了10.0%

【技术实现步骤摘要】
高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程改造
，具体涉及一种高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]纤维素、半纤维素和木质素是植物半纤维素的主要成分，它们共同作用构成了植物细胞壁的支撑骨架，在三者之中半纤维素占据了植物干重的35%以上，半纤维素也是多种复合聚糖的总称，其主要成分为木聚糖，它是一种复杂的多聚五碳糖。木聚糖的主链是通过β
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糖苷键把多个吡喃木糖基连接起来，侧链上连接着多种不同的取代基，主要有乙酰基、葡萄糖醛酰基、L
‑
阿拉伯糖基等，所以木聚糖的完全降解就需要多种酶的共同参与。
[0003]木聚糖酶（Xylanase, EC 3. 2. 1. 8）以内切方式作用于木聚糖的主链，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。木聚糖酶来源非常广泛，可以由不同种类的微生物产生。根据木聚糖酶对酸碱环境的耐受度，可以将其分为碱性、中性和酸性。
[0004]由于木聚糖酶在工业上潜在的应用价值，在近十年内引起了人们更多的注意，其中碱性木聚糖酶主要应用于纸浆和造纸企业。碱性木聚糖酶在造纸行业中的应用主要包括制浆、协助漂白、改纤维性质、废纸脱墨等方面。在工业生产中，制浆过程是在碱性的条件下，用高温蒸煮的方法除去木质素。为使溶解纸浆纤维素纯度达到98%，这就需要大量的氢氧化钠处理纸浆，造成了严重的环境污染，为此许多学者转而尝试生物法处理纸浆，而用于纸浆漂白的木聚糖酶应是耐热和耐碱的。冯建良等用木聚糖酶预处理麦草与常规化学法制浆进行了比较实验，木聚糖酶预处理提高了原料的脱木素程度，还可以降低了纸浆卡伯值。Khasin等得到了一个来源于碱性菌株Bacillus stearothermophilus T26的木聚糖酶，该木聚糖酶在pH 9.0及65
°
C时对纸浆有最好的漂白效果。
[0005]木聚糖酶的酶学性质决定了其在应用上的潜力及应用领域，但是目前木聚糖酶的应用还存在着很多有待解决的问题，木聚糖酶的活性和产量也是其工业应用的制约因素等。基因工程的方法被应用到菌种改良及木聚糖酶的改造中，以研制出符合不同应用领域要求的木聚糖酶产品。例如，曹宇帆等以GH11家族木聚糖酶xyn11A
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LC为基础，建立随机突变基因文库，从中筛选野生型嗜碱性明显提高的三种突变体，通过蛋白质分子模拟，对分析出的关键位点进行定点突变，最后得到了比野生型嗜碱性明显提高的三种突变体。游帅等以来源于Bispora sp.MEY
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1的GH10家族高温木聚糖酶为父本，以来源于Penicillium canescens的GH10家族木聚糖酶XylE为母本，采用分子生物学技术将父本中的区段替换掉母本对应的区段后进行区段组合后表达。在此改造条件下，木聚糖酶突变体比活力较野生型(突变前)的比活性及热稳定性有显著提高。
[0006]目前已有大量的研究改造木聚糖酶的酶学性质以适应不同的应用场景，但比活力性也是限制木聚糖酶应用的一个关键指标。木聚糖酶本身的比活力越高，其生产成本就越低，酶的价格也就越低，也将更有利于促进其被广泛的应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用。所述突变体的比活力比野生型得到显著提高，有利于其在造纸等工业领域中的广泛应用。
[0008]本专利技术一方面涉及一种木聚糖酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：21，23，26，29，103，109，118，151，152，183，184。
[0009]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
[0010]在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
[0011]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：T21S，A23G，T26D，M29V，Y103T，T109V，E118Q/R，V151S/T，G152D，S183D，S184A。
[0012]本专利技术还涉及编码上述木聚糖酶突变体的DNA分子。
[0013]本专利技术还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
[0014]本专利技术还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
[0015]将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的木聚糖酶突变体的比活力得到显著提升。
[0016]在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
[0017]在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
[0018]本专利技术还提供了上述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。
[0019]本专利技术以野生型木聚糖酶Xyn11为基础，提供了包含T21S，A23G，T26D，M29V，Y103T，T109V，E118Q/R，V151S/T，G152D，S183D，S184A中至少一个突变位点的突变体。与野生型木聚糖酶Xyn11相比，所述碱性木聚糖酶突变体的比活力普遍提高了10.0%
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40.0%；其中，含M29V单点突变的碱性木聚糖酶突变体的比活力最高，达905.8 U/mg，取得了意料不到的技术效果。
[0020]综上，本专利技术提供的木聚糖酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低木聚糖酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。
[0021]具体实施方式
[0022]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECΜLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECΜLAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。例如，本专利技术可选用如下实验材料和试剂：菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自Invitrogen公司。
[0023]酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公
司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
[0024]培养基配本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：37，59，63，104，107，167，192。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴秀秀，李馨培，陈刚，鲍锴，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：