一种立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶及其应用，属于基因工程技术领域。该酶ID为5093，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术利用上述基因构建重组菌株，进行原核表达，发现糖苷水解酶5093具有诱导抗病性的能力，该酶在禾本科作物纹枯病防治中发挥重要作用，为开发新型生物农药奠定了基础。为开发新型生物农药奠定了基础。为开发新型生物农药奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶及其应用。

技术介绍

[0002]立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)主要侵染土壤中正在发芽的植物种子，也可以感染豆荚、根、叶和茎，常在水稻、玉米和小麦等禾本科作物上引起纹枯病。病害从茎基部开始向上发展，在叶鞘上形成云纹状浅褐色至黑褐色病斑，严重时还会侵染茎秆，造成茎节腐烂引起倒伏、枯穗等症状。近年来，生物防治成为国内外研究领域的热点之一，充分研究病原菌具诱抗活性效应子的功能与机制，对研究治理纹枯病的新策略具有重大意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术所述的GH64家族糖苷水解酶5093的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0004]5093核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
[0005]atgggtcgtacattcacggtctataatgcatgcccattcactgtttggcccgctatcttcactgacctgaacgttggctcggctgttcccgcaatcga
[0006]aaacggatgggaagcaccagcgttctcaaagcgctccttcaccgttcctgacaactggaaagccggacgcatctggggtcgcacccaatgtga
[0007]tttctcccagaacccaggaatcaagtcctgtctcactggtggatgtaatggtggattggtgtgcgataacaagactggggttggccttccgccggt
[0008]cacttttgccgagtttacgttgggcgctgatctgcaggactatgttgacgtgagcttggtcgacgggttcaacttgccgatgcgtatctcgaacaat
[0009]ggtggatgcggaactgccgagtgcaccgtgaacctcaacaaggattgccctgagcctcttaggggacctttggacaccaatggggatgtcgct
[0010]gcctgcaagtccgcctgcttggctcagatcgataacccgtccgattctccaagctgctgcaccggcgggttccagaaaccttcaacctgccctgc
[0011]ctccggcgtcttgtattatgccttcttcaagaaccgatgcccgaattcctatgtatatgcttacgacgaatcaagcggtactgcattgtggacttgcccttcgtcgaagaaggtcgattatactgtgactttctgtcct。
[0012]5093氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(具体为MKTAVILAAIAGSALGRTFTVYNACPFT VWPAIFTDLNVGSAVPAIENGWEAPAFSKRSFTVPDNWKAGRIWGRTQCDFSQNPGIKSCLTGGCNGGLVCDNKTGVGLPPVTFAEFTLGADLQDYVDVSLVDGFNLPMRISNNGGCGTAECTVNLNKDCPEPLRGPLDTNGDVAACKSACLAQIDNPSDSPSCCTGGFQKPSTCPASGVLYYAFFKNRCPNSYVYAYDESSGTALWTCPSSKKVDYTVTFCP)，N端15个氨基酸为信号肽；分子量大小为45kD。
[0013]本专利技术的目的之一在于提供一种立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶，所述糖苷水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述糖苷水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]本专利技术的目的之二在于提供一种含有上述立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶的表达载体。
[0015]优选地，所述表达载体为pET28a
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sumo。
[0016]本专利技术的目的之三在于提供一种含有上述表达载体的菌株。
[0017]优选地，所述菌株为BL21(DE3)。
[0018]本专利技术的目的之四在于提供上述立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶在禾本科作物纹枯病防治中的应用。
[0019]优选地，所述禾本科作物为玉米。
[0020]本专利技术的目的之五在于提供一种用于防治禾本科作物纹枯病的产品，所述产品中含有上述立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶。
[0021]优选地，所述产品为水剂、可湿性粉剂、粉剂、颗粒剂中的任一种。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0023]本专利技术首次揭示了立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶5093的生物学功能，利用基因组分析及生物信息学分析筛选具有GH64糖苷水解酶家族结构域，从而确定其在侵染寄主植物过程中发挥一定的作用。新型糖苷水解酶是GH64家族，通过原核表达进一步验证5093对玉米具有很好的诱导抗病性能力。
附图说明
[0024]图1为实施例1中信号肽功能验证结果。
[0025]图2为实施例1中诱导表达后蛋白的SDS
‑
PAGE分析结果，其中M为Marker，前代表诱导前，后1、后2分别指代加入阿拉伯糖、IPTG诱导后的菌株。
[0026]图3为实施例1中超声破碎后的蛋白SDS
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PAGE分析结果，其中1代表5093沉淀，2代表上清。
[0027]图4为实施例2中诱导抗病性能力的分析结果，其中46为只接种立枯丝核菌AG4 HG
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III融合群菌株，ck为喷施pET28a
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sumo空载体菌液对照组，5093为喷施5093蛋白处理组。
具体实施方式
[0028]实施例1
[0029](1)糖苷水解酶结构域蛋白的筛选
[0030]本课题组从河北省保定、沧州、邯郸等地采集的谷子纹枯病样本，分离获得其优势致病菌，经形态学及基于ITS的分子生物学鉴定为AG4 HG
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III融合群。利用PacBio及Illumina测序平台对其进行了基因组测序，生物信息学分析获得9个具有糖苷水解酶结构域的蛋白(参见表1)。
[0031]表1鉴定出具有GH64结构域的基因
[0032][0033](2)立枯丝核菌AG4 HG
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III融合群菌株RNA提取
[0034]预冷的研钵中研磨不同时期的玉米叶片至粉末状于1.5mLEP管中并置冰上，加1mL TransZol Up于有样品的EP管中，立即混匀并振荡，于冰上放置10min，加1mL氯仿于EP管中，立即混匀并振荡，于冰上放置10min，温度于4℃、转速13300rpm下离心15min，转移离心后EP管中上清液至新的EP管中，加入相同体积的异丙醇，翻转混匀，
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20℃下冷藏20min，温度4℃、转速12000rpm，离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶，其特征在于，所述糖苷水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶，其特征在于，所述糖苷水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种含有权利要求1或2中所述立枯丝核菌GH64家族糖苷水解酶的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET28a
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sumo。5.一种含有权利要求4中所述表达载体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳悦，李志勇，郝志敏，曾凡力，董金皋，董志平，毛亚楠，刘玉卫，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：