6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途制造技术

本申请涉及6

【技术实现步骤摘要】
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途
[0001]本申请要求2019年1月9日提交的专利申请201910017764.4和2019年5月21日提交的专利申请201910423122.4的优先权。本申请是2019年12月27日提交的专利申请2019113721472《6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途》的分案申请。


[0002]本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种多位点突变的酶6
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磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在检测试剂盒中的应用。

技术介绍

[0003]半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。
[0004]半抗原能与对应抗体结合出现抗原
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抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。
[0005]小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
[0006]甘胆酸(Cholyglycin，CG)，作为半抗原的具体实例，其是胆酸与甘氨酸结合而形成的结合型胆酸，是胆汁酸的主要成分之一。胆固醇在肝细胞内经过一系列复杂的酶催化反应，形成初级胆汁酸，包含胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)，胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12)，侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合成为甘胆酸(图1)。
[0007]甘胆酸由肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物中脂肪的消化吸收。95％胆汁酸在回肠和结肠被重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用，重吸收的甘胆酸又进入肝
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肠循环，通过这种机制，机体能充分利用甘胆酸。
[0008]正常情况下，外周血液中胆酸的含量及其甚微，正常人无论是在空腹还是在餐后，外周血液中的甘胆酸含量均处于非常低的水平。当人体肝细胞受损或者胆汁淤积时，就会引起甘胆酸代谢和循环紊乱，使肝细胞摄取甘胆酸的能力下降，导致血液中甘胆酸含量升高，且甘胆酸值高低与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关。
[0009]测定血清中甘胆酸的含量是评价肝细胞功能及肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。与ALT、AST、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(ALP)、谷酰转肽酶(GGT)、血清白蛋白(ALB)
等常规肝功能检测相比，甘胆酸的测定更加敏感。因此，在慢性肝炎、急性肝炎、肝硬化、肝癌、梗阻性肝病、肝肠循环障碍、胆管、胆囊排泄功能障碍等肝功检测中，甘胆酸可以作为更好的检测指标。
[0010]目前已知的甘胆酸检测方法主要有：放射免疫分析法、酶联免疫法、化学发光免疫分析法、高效液相色谱法、气液色谱法、气相色谱法和质谱联用等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如放射免疫分析法同位素具有放射性污染、有效期较短、操作不方便等诸多弊端，酶联免疫吸附法操作较为繁琐、耗时较长，不适宜在临床上使用。化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(EMIT)和胶乳增强免疫比浊法检测为主。
[0011]均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原(如G6PDH
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CG)与非标记抗原(CG)，竞争与定量的抗体(CG抗体)进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物NAD+生成NADH就越多，在340nm波长下检测NADH的吸光度变化，即可推算出液体中CG的含量。

技术实现思路

[0012]鉴于本领域的需求，本申请提供了一种新型的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备甘胆酸检测试剂盒中的用途。
[0013]根据一些实施方案，提供了一种6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。区别于已有发表的专利US006090567A(Homogeneous immunoassays using mutant glucose
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phosphate dehydrogenases)的6磷酸葡萄糖脱氢酶的突变体，本申请的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变：D306C、G426C、D375C。
[0014]根据一些实施方案，提供了一种6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4。
[0015]根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。
[0016]根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸。
[0017]根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。
[0018]根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本申请的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：n偶联而成。
[0019]在一些实施方案中，n是1至50，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50。
[0020]在一些具体的实施方案中，本申请的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比优选为1：1的定向偶联。
[0021]在一些具体的实施方案中，半抗原的分子量为100Da至4000Da，例如：100、150、200、250、300、350、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、550、570、600、620、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.偶联物在制备检测试剂中的用途，其中：所述偶联物是6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：1偶联而成；相较于野生型假肠膜明串珠菌的6
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磷酸葡萄糖脱氢酶，所述6
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磷酸葡萄糖脱氢酶突变体包含选自以下任一突变：D306C、D375C、G426C；所述半抗原是甘胆酸或甘胆酸衍生物。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述6
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磷酸葡萄糖脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚俊，祁金祥，肖兰萍，张启飞，封建新，王贵利，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：