一种间充质干细胞凋亡小泡递释系统及其构建方法和应用技术方案

本发明专利技术属于药物制剂技术领域，具体为一种间充质干细胞凋亡小泡递释系统及其构建方法和应用。本发明专利技术系统由α

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞凋亡小泡递释系统及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于药物制剂
，具体涉及间充质干细胞凋亡小泡递释系统及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]缺血性脑卒中是指入脑动脉闭塞导致脑缺血而引起的严重的急性脑血管疾病，占卒中的80％以上，具有高发病率、高致残率、高致死率的特点，是目前导致成年人伤残的主要原因之一。缺血性中风发生后，急性缺血导致神经兴奋性毒性和过量活性氧(ROS)产生，梗死区神经元大量坏死。坏死神经元释放损伤相关模式分子(DAMP)激活小胶质细胞向促炎性M1表型极化，促进炎性细胞因子如肿瘤坏死因子
‑
α(TNF
‑
α)，白细胞介素
‑
1β(IL
‑
1β)，白细胞介素
‑
6(IL
‑
6)的大量产生，进一步破坏神经元，造成二次损伤。此外，血管内皮细胞和小胶质细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP)如MMP2、MMP9参与水解细胞外基质及基底膜，进一步破坏血脑屏障(BBB)，还可导致血源性脑水肿的发生。
[0003]静脉滴注重组组织纤溶酶原激活剂(rt
‑
PA)以实现再灌注是当前FDA批准的唯一疗法。然而rt
‑
PA治疗窗窄，须于中风发生后4.5h内进行治疗才能起到实质性疗效。此外，rt
‑
PA半衰期短，治疗后血流再通造成的再灌注损伤可加剧神经元的损伤使得rt
‑
PA溶栓治疗的临床益处大大受限，故而亟需探寻更加有效的治疗方式。血流再通后，在同时清除过量ROS，诱导小胶质细胞向修复性M2表型极化的同时，设法促进受损神经元的存活，促进病灶区微血管再生以改善微循环，将有利于最大程度地促进组织修复，恢复神经功能，起到较好的治疗效果。此外，利用损伤组织区域高表达的MMP，可实现纳米制剂对缺血再灌注病灶组织的响应性靶向。
[0004]目前，有大量研究证明，间充质干细胞来源的细胞外囊泡中含有干细胞的生物活性物质，能够替代干细胞发挥器官及组织损伤修复等重要的生物学功能。间充质干细胞来源的外泌体具有良好的细胞再生和促进修复的能力，已被证明能够促进大鼠和小鼠局灶性脑缺血后的神经恢复和脑重塑。然而，复杂的分离方法和较低的产量使得外泌体在应用实践方面仍存在一些困难。因此，亟需开发一种新型的基于干细胞囊泡的、易于获得的、产量较高的、集多种治疗作用于一体的药物递送治疗系统，有效提高缺血性卒中的治疗效果。
[0005]凋亡小泡是细胞凋亡过程中细胞解体产生的囊泡。细胞凋亡过程受控于独特而精密的信号通路，某些代谢途径在凋亡期间保持活跃，使得凋亡小泡中含有独特的凋亡代谢产物组，这些microRNAs、mRNAs、DNA、蛋白质、脂质能够充当信使，介导细胞间通讯，产生独特的生物学功能。有越来越多的研究表明，吞噬细胞吞噬凋亡小泡后，能够启动和促进组织修复，诱导吞噬细胞向M2抗炎表型转化，因此凋亡小泡特别适合作为调节炎症反应的治疗载体。此外，有研究报道干细胞来源的凋亡小泡能够通过调节受体细胞自噬改善心肌梗死，调节肝巨噬细胞稳态治疗2型糖尿病，介导上皮组织修复过程中的干细胞增殖，促进宫腔黏连模型子宫内膜再生和生育能力的恢复，诱导血管生成促进牙髓再生，表明凋亡小泡在组织修复领域具有极大的应用潜力。与基于细胞的治疗相比，易于大规模生产、较好的稳定性
和易于获得的特点使凋亡小泡在临床治疗方面具有明显的优势。
[0006]本专利技术以人脐带来源的间充质干细胞凋亡小泡为基础构建了多功能间充质干细胞凋亡小泡递释系统α
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M/AB
‑
MAP。在凋亡小泡中装载了天然产物α
‑
倒捻子素，发挥全面的神经保护作用，并且在凋亡小泡膜表面修饰了MMP9响应性激活的细胞穿膜肽MAP，发挥促使凋亡小泡在脑卒中缺血再灌注病灶区域蓄积的作用，使得整个多功能间充质干细胞凋亡小泡治疗系统能够发挥更好的治疗效应。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种安全性高、能为缺血性脑卒中患者有效减少梗死面积、改善神经功能的多功能间充质干细胞凋亡小泡递释系统及其构建方法和应用。
[0008]本专利技术提供的多功能间充质干细胞凋亡小泡递释系统，由如下步骤构建得到：
[0009](1)将一定浓度的α
‑
倒捻子素(记为α
‑
M)与人脐带来源的间充质干细胞(huMSC)共孵育，α
‑
M诱导huMSC凋亡，产生凋亡小泡的同时，通过huMSC对α
‑
M的摄取和α
‑
M与凋亡小泡脂膜的疏水作用得到载有α
‑
M的凋亡小泡，记为α
‑
M/AB；
[0010](2)随后，将α
‑
M/AB与MMP9响应性激活的细胞穿膜肽(MAP)共孵育，制得多功能间充质干细胞凋亡小泡递释系统，记为α
‑
M/AB
‑
MAP。
[0011]步骤(2)中所述MMP9响应性激活的细胞穿膜肽MAP，其序列为：
[0012]Ac
‑
FAEKFKEAVKDYFAKFWD
‑
GSG
‑
RRRRRRRRR
‑
PVGLIG
‑
EGGEGGEGG(SEQ.ID.NO1)。
[0013]该肽由前端的α螺旋(Ac
‑
FAEKFKEAVKDYFAKFWD)通过疏水作用连接到α
‑
M/AB的磷脂双分子层上；随后9个精氨酸组成的富精氨酸穿膜肽(RRRRRRRRR)，在穿膜肽后设计连接一段MMP
‑
2/9敏感肽(PVGLIG)，旨在使其在脑损伤部位特异性地被表达量增高的MMP
‑
2/9水解剪切并暴露出富精氨酸穿膜肽，进而将凋亡小泡带进损伤部位的细胞内，使MAP穿膜肽具脑损伤区靶向性；最后连接一段聚阴离子抑制肽(EGGEGGEGG)，通过正负电荷作用，使精氨酸寡肽的正电荷在循环过程中保持被屏蔽的状态。
[0014]进一步地，步骤(1)的具体过程为：
[0015]将10
‑
15ml含5μg/mlα
‑
M的DMEM低糖无血清培养液与0.5
‑
1.5
×
106个huMSC共孵育3
‑
12h，收集培养液，600
‑
1000g离心2
‑
3次，每次8
‑
12min，取上清，10000
‑
12500g离心15
‑
30min，取沉淀重悬于磷酸盐缓冲液，即获得α
‑
M/AB。
[0016]进一步地，步骤(2)的具体过程为：
[0017]MAP与α
‑
M/AB在磷酸盐缓冲液(PBS)中按照1:100本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞凋亡小泡递释系统的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）将α
‑
倒捻子素α
‑
M与人脐带来源的间充质干细胞huMSC共孵育，α
‑
M诱导huMSC凋亡，产生凋亡小泡的同时，通过huMSC对α
‑
M的摄取和α
‑
M与凋亡小泡脂膜的疏水作用得到载有α
‑
M的凋亡小泡，记为α
‑
M/AB；（2）随后，将α
‑
M/AB与MMP9响应性激活的细胞穿膜肽MAP共孵育，制得多功能间充质干细胞凋亡小泡递释系统，记为α
‑
M/AB
‑
MAP；其中，所述MAP的序列为SEQ.ID.NO 1所示；该肽由前端的α螺旋Ac
‑
FAEKFKEAVKDYFAKFWD通过疏水作用连接到α
‑
M/AB的磷脂双分子层上；随后为9个精氨酸组成的富精氨酸穿膜肽RRRRRRRRR，在穿膜肽后连接一段MMP
‑
2/9敏感肽PVGLIG，旨在使其在脑损伤部位特异性地被表达量增高的MMP
‑
2/9水解剪切并暴露出富精氨酸穿膜肽，进而将凋亡小泡带进损伤部位的细胞内，使MAP穿膜肽具脑损伤区靶向性；最后连接一段聚阴离子抑制肽EGGEGGEGG，通过正负电荷作用，使精氨酸寡肽的正电荷在循环过程中保持被屏蔽的状态。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞凋亡小泡递释系统的构建方法，其特征在于：步骤（1）的具体过程为：将10
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈钧，尤洋，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：