真皮毛乳头细胞球及其体外培养方法、囊泡和用途技术

本发明专利技术属于生物材料和再生医学领域，具体涉及一种真皮毛乳头细胞球及其体外培养方法、囊泡和用途。该真皮毛乳头细胞球是按照以下方法制备得到：从离体真皮毛乳头组织中提取原代真皮毛乳头细胞，传代培养3～5代；将传代后的真皮毛乳头细胞接种于SLF

【技术实现步骤摘要】
真皮毛乳头细胞球及其体外培养方法、囊泡和用途


[0001]本专利技术属于生物材料和再生医学领域，具体涉及一种真皮毛乳头细胞球及其体外培养方法、囊泡和用途。

技术介绍

[0002]全层皮肤缺损的创面组织结构往往无法再生，会以瘢痕形式修复。瘢痕不仅影响外观，而且缺乏皮肤附属器、胶原过度沉积、纤维排列紊乱，组织延展性及抗张能力差，严重影响患者生活质量。尽管创面愈合的治疗策略取得了较大进展，但创面的愈合质量仍然不令人满意。因此，开发一种有效的治疗方法，加速和改善创面愈合便显得尤为重要。近年来，研究发现毛囊及相关干细胞能减少创面愈合后的瘢痕形成。成年小鼠创面新生毛囊周围皮肤组织接近正常皮肤，提示毛囊可能是皮肤再生的关键。临床上利用人体毛囊单位移植修复自体难治性创面的研究证明，移植的毛囊单位可以快速有效地修复患者的严重创面。
[0003]毛乳头细胞(DPCs)是一种特化的间充质干细胞，其位于毛囊的基底部，具有较强的干细胞特性，在特定条件下可向多种细胞分化。毛乳头细胞通过分泌多种生长因子和细胞因子来调节细胞增殖、毛囊发育和血管生成，在上皮
‑
间充质相互作用和毛囊再生中发挥着重要作用，现已成为毛囊再生最为重要的真皮来源干细胞。目前，关于毛囊及相关干细胞在创面愈合过程中减少瘢痕形成的研究尚处于起步阶段，与脂肪干细胞、骨髓干细胞等其它间充质干细胞相比较，DPCs除了能促进新生血管生成、减轻炎症、促进愈合之外，还可改善后期瘢痕情况。此外，DPCs可取自于头发、胡须等人体各部位的体毛，相比其他来源的间充质干细胞具有易于获取，来源丰富，没有伦理限制等优势，在组织再生、创面修复、靶向治疗载体细胞等方面有着广大的应用前景，已被认为是创面无瘢痕愈合的关键的种子细胞。然而，尚无3D真皮毛乳头细胞球(tdDPCs)在促进创面愈合，特别是瘢痕治疗方面的研究报道和相关产品。

技术实现思路

[0004]鉴于以上技术问题，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]本专利技术第一个目的，提供一种真皮毛乳头细胞球的体外培养离方法，包括以下步骤：
[0006]从离体真皮毛乳头组织中提取原代真皮毛乳头细胞，传代培养3～5代；
[0007]将传代后的真皮毛乳头细胞接种于SLF
‑
3D培养体系中培养，待真皮毛乳头细胞生长至融合度为90～100％时，收集半悬浮的球体，将球体分离成为单个细胞，再将单个细胞重新接种到原SLF
‑
3D培养体系中培养3～5d，收集形成的悬浮球体，即为真皮毛乳头细胞球；
[0008]其中，所述SLF
‑
3D培养体系是以DEME/F
‑
12作为溶剂，以所述SLF
‑
3D培养体系的总体积计，所述SLF
‑
3D培养体系还包括以下原料：2～3％胎牛血清
、
人碱性成纤维细胞生长因子4～6ng/mL、人表皮生长因子0.8～3ng/mL、人血小板衍生生长因子4～6ng/mL、肝素1～
3ug/mL、L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸倍半钠水合物30～60ug/mL、青霉素80～120U/mL。
[0009]优选地，所述真皮毛乳头细胞在SLF
‑
3D培养液中的接种量为5～6
×
104个/cm2。
[0010]优选地，以所述SLF
‑
3D培养体系的总体积计，所述SLF
‑
3D培养体系包括以下原料：3％胎牛血清
、
人碱性成纤维细胞生长因子5ng/mL、人表皮生长因子2ng/mL、人血小板衍生生长因子5ng/mL、肝素2ug/mL、L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸倍半钠水合物50ug/mL、青霉素100U/mL。
[0011]优选地，原代真皮毛乳头细胞的提取是采用显微分离结合改良酶消化法从离体鼠触须末端毛球部提取得到。
[0012]优选地，所述传代培养的具体培养过程为：先将所述原代真皮毛乳头细胞接种到含20％(体积分数)胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液中培养
，
待生长融合度为80～90％时，传代，此后更换为含10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液继续培养。
[0013]本专利技术第二个目的，提供一种根据上述方法得到的真皮毛乳头细胞球。
[0014]本专利技术第三个目的，提供一种所述真皮毛乳头细胞球的细胞外囊泡，其是按照以下方法制备得到：将所述真皮毛乳头细胞球在装有DMEM/F
‑
12培养液的超低黏附培养皿中悬浮培养24h后，收集培养上清液，离心，即得。
[0015]本专利技术第四个目的，提供一种所述真皮毛乳头细胞球或所述细胞外囊泡在制备抑制瘢痕形成和/或促进皮肤附属器再生和/或促进血管新生的产品中的用途。
[0016]优选地，所述真皮毛乳头细胞球或所述细胞外囊泡用于制备促进角质形成细胞增殖和/或迁移的产品；
[0017]所述真皮毛乳头细胞球或所述细胞外囊泡用于制备促进成纤维细胞增殖和/或迁移的产品；
[0018]所述真皮毛乳头细胞球或所述细胞外囊泡用于制备促进血管内皮细胞增殖和/或迁移的产品。
[0019]本专利技术第五个目的，提供一种抑制瘢痕形成和/或促进皮肤附属器再生和/或促进血管新生的产品，其特征在于，其包括所述真皮毛乳头细胞球和/或所述细胞外囊泡。
[0020]优选地，所述产品为药物或化妆品。
[0021]对比现有技术，本专利技术的有益效果是：
[0022]1、本专利技术利用自饲养层3D间充质干细胞培养系统(即SLF
‑
3D培养体系)，成功培养得到了全新真皮毛乳头细胞球tdDPCs，通过转录组测序比较了DPCs与tdDPCs细胞的基因差异，结果表明，与DPCs比较，tdDPCs中与抑制瘢痕、促进毛囊再生、血管新生的相关基因明显上调；并通过动物实验证实，tdDPCs比DPCs具有更好的创面无瘢痕愈合的治疗效果。
[0023]2、本专利技术进一步提取了tdDPCs及DPCs的细胞外囊泡，与DPCs比较，tdDPCs的囊泡产量更高(约为其5倍)，且囊泡粒径更小(约为其1/2，研究表明小粒径囊泡更便于负载给药和渗透)；体内和体外实验证实，tdDPCs囊泡比DPCs囊泡在创面无瘢痕愈合方面具有明显的优势；细胞水平和动物实验均表明，与DPCs囊泡比较，tdDPCs囊泡促进了创面血管新生、血管成熟，促进了创面上皮化、促进了创面皮肤附属器再生，降低了瘢痕相关标记物的表达且创面愈合后胶原排列规则有序。最终，tdDPCs囊泡治疗后的创面皮肤组织病理结果显示与周围正常皮肤无明显差异。
[0024]3、本专利技术提供的真皮毛乳头细胞球及其囊泡对全层皮肤损伤的创面均具有很好的愈合效果，tdDPCs及其EVs可通过促进角质形成细胞的增殖和迁移来促进创面上皮修复，
通过促进成纤维细胞的增殖和迁移并抑制成纤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种真皮毛乳头细胞球的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：从离体真皮毛乳头组织中提取原代真皮毛乳头细胞，传代培养3～5代；将传代培养后的真皮毛乳头细胞接种于SLF
‑
3D培养体系中培养，待真皮毛乳头细胞生长至融合度为90～100％时，收集半悬浮的球体，将球体分离成为单个细胞，再将单个细胞重新接种到原SLF
‑
3D培养体系中培养3～5d，收集形成的悬浮球体，即为真皮毛乳头细胞球
；
其中，所述SLF
‑
3D培养体系是以DEME/F
‑
12作为溶剂，以所述SLF
‑
3D培养体系的总体积计，所述SLF
‑
3D培养体系还包括以下原料：2～3％胎牛血清
、
人碱性成纤维细胞生长因子4～6ng/mL、人表皮生长因子0.8～3ng/mL、人血小板衍生生长因子4～6ng/mL、肝素1～3ug/mL、L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸倍半钠水合物30～60ug/mL、青霉素80～120U/mL。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真皮毛乳头细胞在SLF
‑
3D培养体系中的接种量为5～6
×
104个/cm2。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以所述SLF
‑
3D培养体系的总体积计，所述SLF
‑
3D培养体系包括以下原料：3％胎牛血清
、
人碱性成纤维细胞生长因子5ng/mL、人表皮生长因子2ng/mL、人...

【专利技术属性】
技术研发人员：王运帷，官浩，杨云舒，张万福，沈括，张浩，曹鹏，李少珲，陈阳，张清怡，王彬，许朝磊，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：