一种适用于工业化水平的外泌体纯化方法和质量控制方法技术

本发明专利技术属于外泌体纯化和表征技术领域，具体涉及一种适用于工业化水平的外泌体纯化方法和质量控制方法。本发明专利技术建立了一个结合TFF和整体强阴离子交换色谱的外泌体纯化过程，选用核酸酶去除染色质污染，旨在为工业水平大规模制备可用于临床的天然外泌体或工程化外泌体纯化提供一个可选择的参考。同时，本发明专利技术还建立了一个结合NTA，WB，TEM，ExoView和FFF

【技术实现步骤摘要】
一种适用于工业化水平的外泌体纯化方法和质量控制方法


[0001]本专利技术属于外泌体纯化和表征
，具体涉及一种适用于工业化水平的外泌体纯化方法和质量控制方法。

技术介绍

[0002]外泌体是生物制药行业治疗领域内迅速增长的一个方向，外泌体来源细胞包括间充质干细胞，这是外泌体在再生医学领域特别受到关注的原因。最近的研究记录了间充质干细胞外泌体逆转严重中风影响的能力，强调了它们的治疗潜力。同时也强调了需要可扩展的纯化技术来推动这些产品通过临床试验并获得许可生产。
[0003]外泌体的最终目的是作为生物制剂应用于临床，因此必须符合现有生物制剂安全性标准，宿主蛋白质、DNA、病毒和内毒素必须减少到安全水平。同时外泌体产品必须保持活性和可进行浓缩以保持剂量可控。工业化外泌体纯化必须考虑选用工艺的可放大性，以及对外泌体结构和生物学完整性的保护，减少外泌体的聚集，非外泌体颗粒及其他蛋白污染，提高外泌体产量和纯度，同时，这个过程必须是经济的和可扩展的，但是目前并没有可供工业化大规模生产并纯化外泌体的方案，且缺乏统一的质量控制体系。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种适用于工业化水平的外泌体纯化方法和质量控制方法，为工业水平大规模制备可用于临床的天然外泌体或工程化外泌体纯化以及质量控制提供一个可选择的参考。
[0005]本专利技术提供了一种适用于工业化水平的外泌体纯化方法，包括以下步骤：
[0006](1)对外泌体供体细胞的上清液通过双层玻璃纤维过滤器，得外泌体澄清液；
[0007](2)将步骤(1)得到的所述外泌体澄清液通过聚醚砜液体过滤器，得无菌澄清液；
[0008](3)将步骤(2)得到的所述无菌澄清液过纤维素基膜进行切向流过滤，得切向流过滤液；
[0009](4)将步骤(3)得到的所述切向流过滤液经中空纤维切向流过滤后结合核酸酶孵育，得无染色质外泌体液；
[0010](5)将步骤(4)得到的所述无染色质外泌体液经整体强阴离子交换色谱柱，收集纯化峰，得纯化的外泌体。
[0011]优选的，步骤(1)中使用SartoriusGF预过滤器对收集的外泌体供体细胞的上清液进行恒流过滤；
[0012]所述SartoriusGF的滤径为0.65μm。
[0013]优选的，步骤(2)中使用Sartorius2XLG过滤器对外泌体澄清液进行除菌过滤；
[0014]Sartorius2XLG过滤器的孔径为0.8/0.2μm。
[0015]优选的，步骤(3)中使用Sartorius300kDa 0.1m2超滤膜包对所述无菌澄清液进行切向流过滤。
[0016]优选的，步骤(4)中使用Sartorius Single
‑
use hollow fiberTFF，将核酸酶Kryptonase和切向流过滤液进行溶液短循环后孵育1h；
[0017]所述Sartorius Single
‑
use hollow fiberTFF的通过粒径不大于750kDa。
[0018]优选的，在步骤(4)所述孵育后，还包括将得到的无染色质外泌体液再经过一次Sartorius Single
‑
use hollow fiberTFF。
[0019]优选的，步骤(5)中使用Sartorius BIA Separations CIMmultus
TM EV 1ml 2μm整体柱对所述无染色质外泌体液进行外泌体精细纯化。
[0020]本专利技术还提供了一种在外泌体生产和纯化过程中的质量控制方法，包括在外泌体生产和纯化过程中，进行(1)纳米颗粒跟踪分析、(2)蛋白免疫印迹分析、(3)透射电镜扫描、(4)基于18角度激光光散射
‑
场流分离检测系统对外泌体的分离和鉴定和(5)基于Exoview的外泌体亚群分析。
[0021]优选的，蛋白免疫印迹分析包括检测外泌体特异性标记物Alix、TSG101、CD63、CD9、CD81、Syntenin
‑
1等。
[0022]优选的，所述外泌体亚群分析包括基于ExoView的外泌体亚群分析，或通过检测样品中Syntenin
‑
1的表达水平，实现外泌体完整囊泡和外泌体囊泡碎片的分析。
[0023]有益效果：本专利技术提供了一种适用于工业化水平的外泌体纯化方法，建立了一个结合切向流过滤(Tangential flow filtering，TFF)和整体强阴离子交换色谱(StrongAnionExchanger)的外泌体纯化过程，选用核酸酶去除染色质污染，旨在为工业水平大规模制备可用于临床的天然外泌体或工程化外泌体纯化提供一个可选择的参考。同时，本专利技术还建立了一个结合纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle TrackingAnalysis，NTA)，蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)，透射电镜(Transmission ElectronMicroscope，TEM)，全自动外泌体荧光检测系统ExoView和场流分离
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18角光散射检测(Field
‑
flow fractionation
‑
Multi
‑
angle Light Scattering，FFF
‑
MALS)的整体外泌体质控体系。
[0024]利用本专利技术所述外泌体纯化方法以及质量控制方法，可以对样本中外泌体物理性质和生物属性进行链接，实现目前科技条件下最精准的外泌体表征，进而实现工艺各个阶段外泌体样本的质量控制，并得到几乎无染色质污染的外泌体。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]图1为工业水平的大规模外泌体纯化工艺流程(A)及质控体系(B)总览图；
[0027]图2为澄清过滤过程滤速压差载体变化图；
[0028]图3为外泌体样品特异性蛋白表达检测结果图；
[0029]图4为除菌过滤过程滤速压差载体变化图；
[0030]图5为TFF过程滤速TMP时间变化曲线；
[0031]图6为E、F电镜下外泌体结构；
[0032]图7为层析图谱；
[0033]图8为G、H、I电镜下外泌体结构图；
[0034]图9为归一化样品紫外信号洗脱对比结果图；
[0035]图10为归一化样品光散射信号洗脱图对比结果图；
[0036]图11为洗脱颗粒粒径浓度分析结果图；
[0037]图12为G样本外泌体CD63、CD81、CD9亚群分析结果图；
[0038]图13为H样品外泌体CD63、CD81、CD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于工业化水平的外泌体纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对外泌体供体细胞的上清液通过双层玻璃纤维过滤器，得外泌体澄清液；(2)将步骤(1)得到的所述外泌体澄清液通过聚醚砜液体过滤器，得无菌澄清液；(3)将步骤(2)得到的所述无菌澄清液过纤维素基膜进行切向流过滤，得切向流过滤液；(4)将步骤(3)得到的所述切向流过滤液经中空纤维切向流过滤后结合核酸酶孵育，得无染色质外泌体液；(5)将步骤(4)得到的所述无染色质外泌体液经整体强阴离子交换色谱柱，收集纯化峰，得纯化的外泌体。2.根据权利要求1所述外泌体纯化方法，其特征在于，步骤(1)中使用SartoriusGF预过滤器对收集的外泌体供体细胞的上清液进行恒流过滤；所述SartoriusGF的滤径为0.65μm。3.根据权利要求1所述外泌体纯化方法，其特征在于，步骤(2)中使用Sartorius2XLG过滤器对外泌体澄清液进行除菌过滤；Sartorius2XLG过滤器的孔径为0.8/0.2μm。4.根据权利要求1所述外泌体纯化方法，其特征在于，步骤(3)中使用Sartorius300kDa 0.1m2超滤膜包对所述无菌澄清液进行切向流过滤。5.根据权利要求1所述外泌体纯化方法，其特征在于，步骤(4)中使用Sartorius Single
‑
use hollow fiberTFF，将核酸酶Kryptonase和切向流过滤液进行溶液短循环后孵育1h；所述Sartorius Sin...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷欣华，金倞，梁磊，高雷，
申请(专利权)人：北京吉中科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：