一种缺氧间充质干细胞外泌体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种缺氧间充质干细胞外泌体及其应用，属于生物医学技术领域。本发明专利技术所述缺氧间充质干细胞外泌体由0.5％～3％氧气浓度预处理40～50h的人脐带间充质干细胞分泌得到。本发明专利技术所述外泌体能促进脊髓星形胶质细胞向A2极化，增强脊髓组织神经丝蛋白和微管蛋白的表达，进而促进脊髓组织结构修复，达到脊髓损伤运动功能恢复的效果。髓损伤运动功能恢复的效果。髓损伤运动功能恢复的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种缺氧间充质干细胞外泌体及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，尤其涉及一种缺氧间充质干细胞外泌体及其应用。

技术介绍

[0002]脊髓损伤(SCI)是一种毁灭性的疾病，通常会导致永久性截瘫，给患者带来巨大的身体痛苦和经济损失。脊柱减压手术和大剂量的糖皮质激素(如甲泼尼松龙)是目前主要的临床治疗方法。但是这些治疗方法使患者完全恢复的可能性很低，并且会带来很多副作用。脊髓损伤的病理生理过程与星形胶质细胞极化关系密切。正常情况下，脊髓星形胶质细胞具有广泛的功能，包括神经递质循环、突触发生调节、血脑屏障的形成和维持、环境稳态和免疫信号传导等，一旦中枢神经系统发生创伤或发病，星形胶质细胞就会被诱导激活，并出现A1和A2两种极化状态。A1星形胶质细胞被发现释放补体成分、炎症细胞因子等神经毒性因子，介导神经元和少突胶质细胞死亡，从而促进神经病理进展。相反，A2星形胶质细胞通过产生抗炎细胞因子和神经营养因子表现出神经保护功能，从而促进中枢神经系统的恢复和修复。因此，脊髓损伤后星形胶质细胞不同极化的反应性会影响脊髓功能的恢复。
[0003]间充质干细胞来源的外泌体包含许多不同的成分，包括DNA、RNA、脂质、蛋白质和代谢物。外泌体可以通过各自途径到达受体细胞并传递治疗性分子，可以在组织修复、免疫调节和神经保护中发挥重要作用。由于间充质干细胞在体内通常处于干细胞龛的缺氧环境中，因此在体外的缺氧环境更有利于维持它们的增殖、分化和自我更新。但是，目前并没有缺氧预处理间充质干细胞来源的外泌体在治疗脊髓损伤方面的报道。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供了一种缺氧间充质干细胞外泌体及其应用，所述缺氧间充质干细胞外泌体能够调控星形胶质细胞向A2型极化，促进脊髓损伤的恢复，改善脊髓损伤大鼠的运动功能。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]一种缺氧间充质干细胞来源的外泌体，所述外泌体由0.5％～3％氧气浓度预处理40～50h的人脐带间充质干细胞分泌得到。
[0007]本专利技术还提供了上述外泌体的制备方法，将人脐带间充质干细胞于0.5％～3％O2培养40～50h，收集细胞上清液，经过4～6个连续离心处理，得到所述外泌体。
[0008]本专利技术还提供了上述缺氧间充质干细胞外泌体在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。
[0009]优选的，所述缺氧间充质干细胞外泌体能促进脊髓损伤运动功能恢复。
[0010]优选的，所述缺氧间充质干细胞外泌体能促进脊髓组织结构修复。
[0011]优选的，所述缺氧间充质干细胞外泌体能促进脊髓组织神经丝蛋白的表达。
[0012]优选的，所述缺氧间充质干细胞外泌体能增强脊髓组织神经微管蛋白的表达。
[0013]优选的，所述缺氧间充质干细胞外泌体能促进脊髓星形胶质细胞向A2极化。
[0014]优选的，所述缺氧间充质干细胞外泌体的注射剂量为2.0～2.5mg。
[0015]优选的，所述药物包括活性成分缺氧间充质干细胞外泌体及药学上可接受的载体。
[0016]相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0017]本专利技术提供了一种缺氧间充质干细胞外泌体及其应用，所述缺氧间充质干细胞外泌体由0.5％～3％氧气浓度预处理40～50h的人脐带间充质干细胞分泌得到。本专利技术所述外泌体能促进脊髓星形胶质细胞向A2极化，增强脊髓组织神经丝蛋白和微管蛋白的表达，进而促进脊髓组织结构修复，达到脊髓损伤运动功能恢复的效果。
附图说明
[0018]图1为间充质干细胞来源的外泌体(NEx)和缺氧预处理间充质干细胞来源的外泌体(HEx)的鉴定；A为透射电镜下NEx和HEx的代表性图像；B为采用纳米颗粒跟踪分析外泌体的大小分布；C Westernblot验证了外泌体标志物包括CD63、CD9、Alix和TSG101以及外泌体阴性生物标志物calnexin；
[0019]图2为NEx和HEx促进脊髓损伤SD大鼠后肢运动功能恢复的结果；A为SD大鼠脊髓损伤后不同时间运动功能BBB评分；B为SD大鼠术后第四周运动墨迹试验结果代表性图像；C为术后第四周SD大鼠步长分析结果；D为术后第四周SD大鼠步宽分析结果；
[0020]图3为NEx和HEx促进SD大鼠脊髓组织修复的结果；A为脊髓组织HE染色代表图像；B为脊髓组织神经丝蛋白(NF)的免疫组织化学染色结果；C为脊髓组织神经微管蛋白(MAP2)的组织免疫荧光结果；D为Westernblot检测脊髓组织NF和MAP2的代表性图像；E为对D图Westernblot结果灰度扫描统计分析；
[0021]图4为NEx和HEx促进大鼠脊髓星形胶质细胞向A2极化的结果；A为Westernblot检测脊髓组织星形胶质细胞极化指标C3和S100A10的代表性图；B为定量PCR检测星形胶质细胞极化指标C3、H2
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T23、Sgrn、S100A10、Emp1和SPHK1的表达；C为组织免疫荧光检测脊髓组织C3和GFAP双阳细胞的代表性图像；D为组织免疫荧光检测脊髓组织S100A10和GFAP双阳细胞的代表性图像。
具体实施方式
[0022]本专利技术提供了一种缺氧间充质干细胞来源的外泌体，所述外泌体由0.5％～3％氧气浓度预处理40～50h的人脐带间充质干细胞分泌得到。
[0023]本专利技术还提供了上述外泌体的制备方法，优选包括：将人脐带间充质干细胞于0.5％～3％O2培养40～50h，收集细胞上清液，经过4～6个连续离心处理，得到所述外泌体。所述氧气浓度更优选为1％，所述培养时间更优选为48h；所述离心温度优选为0～10℃，更优选为4℃，所述离心次数优选为5个，更优选的，离心处理包括：将所述细胞上清液500g离心10min、2000g离心10min、10000g离心30min，再超滤2000g离心30min，浓缩，最后将浓缩液100000g离心，70min，最后用PBS重悬得到所述外泌体。
[0024]本专利技术还提供了上述缺氧间充质干细胞外泌体在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。
[0025]在本专利技术中，所述缺氧间充质干细胞外泌体能促进脊髓损伤运动功能恢复。在动物实验中，Sham组、PBS组、NEx组和HEx组大鼠模型构建成功后，第1周，第2周，第3周，第4周进行BBB运行功能评分，Sham组、PBS组、NEx组和HEx组大鼠的平均BBB评分分别为21，7，12和15。评分结果表明，外泌体可以促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复，本专利技术外泌体相对于NEx具有更好的恢复效果。
[0026]在本专利技术中，所述缺氧间充质干细胞外泌体能促进脊髓组织结构修复。在动物实验中，采用大鼠墨迹实验对Sham组、PBS组、NEx组和HEx组大鼠进行步态分析，外泌体处理后大鼠后肢拖动面积减少，步长增加，步宽减少。实验结果表明，外泌体治疗可以提高脊髓损伤大鼠后肢运动功能，本专利技术外泌体相对于NEx具有更好的脊髓组织结构修复效果。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种缺氧间充质干细胞来源的外泌体，其特征在于，所述外泌体由0.5％～3％氧气浓度预处理40～50h的人脐带间充质干细胞分泌得到。2.权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于，将人脐带间充质干细胞于0.5％～3％O2培养40～50h，收集细胞上清液，经过4～6个连续离心处理，得到所述外泌体。3.权利要求1所述缺氧间充质干细胞外泌体或权利要求2所述制备方法得到的外泌体在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述缺氧间充质干细胞外泌体的注射剂量为2.0～2.5mg。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述缺氧间充...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文荣，陈深元，钱晖，孙丰田，朱珺彦，孙云彤，刘中，尉一凡，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：