一种用于生发育发的干细胞培养上清的生产方法技术

本发明专利技术属于医用生物材料技术领域，尤其是涉及一种用于生发育发的干细胞培养上清的生产方法，包括步骤(一)：在不含血清的干细胞培养基中对间充质干细胞进行培养；步骤(二)：用乙酸乙酯溶液经过萃取和纯化后所得到的无细胞上清液制备乙酸乙酯提取液，对乙酸乙酯提取液经过离心、过滤和冻干，得到干细胞培养上清，并备用；步骤(三)：将步骤(二)所得干细胞培养上清中加入硫酸铵，并进行搅拌、静置和离心，最后取沉淀并加水溶解、过滤，随后得蛋白滤液。本发明专利技术将间充质干细胞和生物活性玻璃体相结合，可促进皮肤创面的快速愈合，也能够提高骨细胞诱导分化的效果，适用于常见的各种较难愈合的创面，适用范围较广，而且在使用时异物感不强烈。烈。

【技术实现步骤摘要】
一种用于生发育发的干细胞培养上清的生产方法


[0001]本专利技术属于医用生物材料
，尤其是涉及一种用于生发育发的干细胞培养上清的生产方法。

技术介绍

[0002]干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞，干细胞上清液是指从干细胞培养液中去除干细胞以及其他所有细胞成分后所余留的液体，余留的液体由培养基、细胞因子以及外泌体三部分组成，上清液中含有大量细胞活性物质，主要功能是加速修复，促进细胞活化，让细胞存活率更高，从而达到“逆生长”的效果，经过研究发现干细胞上清对于生发育发具有良好的效果。
[0003]由于干细胞上清对于生发育发具有良好的效果，因此人们通常利用干细胞上清进行生发育发，能够促进头发的生长，因而深受人们的欢迎，而目前市面上常见的用于生发育发的干细胞培养上清的生产方法，依然存在细胞增殖较慢、状态不稳定、易分化，而影响干细胞培养上清的使用等问题。因此，急需对现有的用于生发育发的干细胞培养上清的生产方法进行改进，提供一种用于生发育发的干细胞培养上清的生产方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种设计合理，结构简单，细胞增殖速度快、状态稳定且不易分化的用于生发育发的干细胞培养上清的生产方法，用于解决现有技术中存在的细胞增殖较慢、状态不稳定、易分化，而影响干细胞培养上清的使用等问题。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种用于生发育发的干细胞培养上清的生产方法，其包括
[0007]步骤(一)：将脂肪干细胞在含碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基中培养，得到培养上清液Ⅰ；
[0008]步骤(二)：将所述培养上清液Ⅰ进行离心，得到培养上清液Ⅱ；
[0009]步骤(三)：将步骤(二)所得上清Ⅱ中加入硫酸铵，随后进行搅拌、静置和离心，最后取沉淀并加水溶解，最后过滤得到蛋白滤液；
[0010]步骤(四)：将步骤(三)所得蛋白滤液经凝胶柱纯化，得纯化上清：
[0011]步骤(五)：制备细胞培养液，取脂肪干细胞条件培养液660～700mL，血清替代物80～220mL，非必需氨基酸5～45g，核苷10～35g，L
‑
谷氨酰胺的摩尔浓度为2～4mM，β
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巯基乙醇的摩尔浓度为0.3～0.8mM，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为2～7μg/L，干细胞生长因子的浓度为4～15μg/L；
[0012]步骤(六)：将步骤(四)所得纯化上清进行冻干，得到冻干上清，并备用；
[0013]步骤(七)：按照质量份数依次称取冻干上清、甲基纤维素、壳聚糖、生物活性玻璃体、透明质酸钠、植物精油、纯净蒸馏水、凝胶固化剂以及细胞培养液；
[0014]步骤(八)：将制备得到的冻干上清用纯净蒸馏水溶解，依次加入甲基纤维素、壳聚糖、生物活性玻璃体、透明质酸钠、植物精油凝胶固化剂以及细胞培养液，并将上述原料进行搅拌混合均匀，即得干细胞培养上清。
[0015]作为一种优选的实施方式，所述步骤(一)中，所述含碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基中，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5～ 10ng/mL。
[0016]作为一种优选的实施方式，所述步骤(一)中培养的时间为20～30h。
[0017]作为一种优选的实施方式，所述步骤(二)中离心条件依次为转速 6000rpm
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7000rpm、温度3℃、时间15min
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20min和转速8000rpm
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9500rpm、温度3℃、时间10min
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20min。
[0018]作为一种优选的实施方式，所述干细胞培养上清按照质量份数计，由冻干上清15～30份、甲基纤维素20～25份、壳聚糖10～15份、生物活性玻璃体10～15份、透明质酸钠10～13份、植物精油10～12份、凝胶固化剂2～3 份以及细胞培养液组成。
[0019]作为一种优选的实施方式，所述步骤(一)中培养的温度为36℃。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
[0021]在本专利技术的方案中：
[0022]通过一定浓度碱性成纤维细胞生长因子作用于脂肪干细胞，使生成的脂肪干细胞条件培养液具备了抑制嗜酸性细胞分化，维持其正常生长的能力，而且纤维细胞生长因子还能促进脂肪干细胞的增殖和分泌能力，进而能更好的促进胚胎干细胞的生长和增殖，因此，本专利技术所提供的干细胞培养上清，可以促进胚胎干细胞的增殖，而且还能够抑制其分化，能够更好的进行生发育发，效果更明显。
具体实施方式
[0023]以下所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，并不代表与本专利技术相一致的所有实施例，对示例性实施例进行如下说明：
[0024]本专利技术用于生发育发的干细胞培养上清的生产方法，其包括
[0025]步骤(一)：将脂肪干细胞在含碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基中培养，得到培养上清液Ⅰ；
[0026]步骤(二)：将培养上清液Ⅰ进行离心，得到培养上清液Ⅱ；
[0027]步骤(三)：将步骤(二)所得上清Ⅱ中加入硫酸铵，随后进行搅拌、静置和离心，最后取沉淀并加水溶解，最后过滤得到蛋白滤液；
[0028]步骤(四)：将步骤(三)所得蛋白滤液经凝胶柱纯化，得纯化上清：
[0029]步骤(五)：制备细胞培养液，取脂肪干细胞条件培养液660～700mL，血清替代物80～220mL，非必需氨基酸5～45g，核苷10～35g，L
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谷氨酰胺的摩尔浓度为2～4mM，β
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巯基乙醇的摩尔浓度为0.3～0.8mM，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为2～7μg/L，干细胞生长因子的浓度为4～15μg/L；
[0030]步骤(六)：将步骤(四)所得纯化上清进行冻干，得到冻干上清，并备用；
[0031]步骤(七)：按照质量份数依次称取冻干上清、甲基纤维素、壳聚糖、生物活性玻璃体、透明质酸钠、植物精油、纯净蒸馏水、凝胶固化剂以及细胞培养液；
[0032]步骤(八)：将制备得到的冻干上清用纯净蒸馏水溶解，依次加入甲基纤维素、壳聚糖、生物活性玻璃体、透明质酸钠、植物精油凝胶固化剂以及细胞培养液，并将上述原料进
行搅拌混合均匀，即得干细胞培养上清。
[0033]作为优选的实施方式，在上述结构的基础上，进一步的，步骤(一)中，含碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基中，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5～10ng/mL。
[0034]作为优选的实施方式，在上述结构的基础上，进一步的，步骤(一)中培养的时间为20～30h。
[0035]作为优选的实施方式，在上述结构的基础上，进一步的，步骤(二)中离心条件依次为转速6000rpm
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7000rpm、温度3℃、时间15min
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20min和转速 800本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生发育发的干细胞培养上清的生产方法，包括步骤(一)：将脂肪干细胞在含碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基中培养，得到培养上清液Ⅰ；步骤(二)：将所述培养上清液Ⅰ进行离心，得到培养上清液Ⅱ；步骤(三)：将步骤(二)所得上清Ⅱ中加入硫酸铵，随后进行搅拌、静置和离心，最后取沉淀并加水溶解，最后过滤得到蛋白滤液；步骤(四)：将步骤(三)所得蛋白滤液经凝胶柱纯化，得纯化上清：步骤(五)：制备细胞培养液，取脂肪干细胞条件培养液660～700mL，血清替代物80～220mL，非必需氨基酸5～45g，核苷10～35g，L
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谷氨酰胺的摩尔浓度为2～4mM，β
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巯基乙醇的摩尔浓度为0.3～0.8mM，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为2～7μg/L，干细胞生长因子的浓度为4～15μg/L；步骤(六)：将步骤(四)所得纯化上清进行冻干，得到冻干上清，并备用；步骤(七)：按照质量份数依次称取冻干上清、甲基纤维素、壳聚糖、生物活性玻璃体、透明质酸钠、植物精油、纯净蒸馏水、凝胶固化剂以及细胞培养液；步骤(八)：将制备得到的冻干上清用纯净蒸馏水溶解，依次加入甲基纤维素、壳聚糖、生物活性玻璃体、透明质酸钠、植物精油凝胶固化剂以及细胞培养液，并将上述原料进行搅拌混合均匀，即得干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：董亮，刘柳，赵静敏，
申请(专利权)人：北京赛维森国际生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：