一种人源脐带来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒及组织贴壁培养方法技术

本发明专利技术涉及一种人源脐带来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒及组织贴壁培养方法，属于干细胞培养技术领域。本发明专利技术所述优化培养基包括：基础培养基、血清替代物和补充剂。本发明专利技术所述优化培养基能够保证MSC在多次传代扩增后仍能保持其专一的细胞表型和多向分化潜能，最大限度地缩短细胞从组织内分离到适应体外培养环境过程的时间、最大限度地提高单位时间内的细胞产量，缩短代次培养间的时间，进而提高细胞性能并满足临床应用监管要求，可在体外更好的扩增人类间充质干细胞，最大限度地提高MSC体外扩增效率并减少批次间细胞的差异。MSC体外扩增效率并减少批次间细胞的差异。MSC体外扩增效率并减少批次间细胞的差异。

【技术实现步骤摘要】
一种人源脐带来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒及组织贴壁培养方法
[0001]本申请要求于2021年12月03日提交中国专利局、申请号为202111467116.2、专利技术名称为“一种人源脐带来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒及组织贴壁培养方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。


[0002]本专利技术涉及干细胞培养
，具体涉及一种人源脐带来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒及组织贴壁培养方法。

技术介绍

[0003]干细胞存在于身体的各种器官和组织中，它们具有再生潜力，同时在整个人类生命周期中，此类细胞在修复体内受损组织方面发挥重要作用。这引起了人们对成体干细胞(ASC)的极大兴趣，特别是因为与胚胎干细胞(ESC)不同，ASC的使用不会造成道德和伦理困境。一些研究报告了ASCs的分离，例如间充质基质细胞(MSCs)，造血干细胞(HSC)以及其他不同的祖细胞，包括从骨髓(BM)到脂肪组织(AT)和牙髓的各种成人来源。然而，大多数(1)成人生态位中存在的ASC是有限的，并且，(2)它们的提取通常涉及具有潜在供体部位发病率以及组织侵入性的痛苦过程。此外，(3)供体年龄和环境压力也可能在确定分离细胞的质量和生物活性方面发挥重要作用。同时，(4)ASCs在体外培养过程中也显示出有限的增殖能力和分化潜能。
[0004]为了克服当前ASC的这些缺点，人们一直在寻求新的来源进行干细胞的分离。这些尝试发展为从围产期来源中分离出干细胞，包括脐带血、脐带组织、胎盘、羊膜和羊水。这些(1)来源因其具有容易获取和丰富的可用性被广泛关注。此外，(2)围产期组织可以非侵入性的方式获得，从它们中提取的干细胞比从成人来源分离的ASC更原始。它们是从出生时获得的组织中分离出来，并且(3)被认为不存在由于老化和环境压力而在基因组中发生了最小的变化。
[0005]然而，来自围产期来源的干细胞的报告特征及其自我更新和分化的潜力差距很大。现有脐带来源间充质干细胞提取工艺条件一般是将脐带组织作为一个整体，使用组织块贴壁法获得间充质干细胞，但是(1)不同组织位置获得的细胞自我更新和分化潜力具有差异，(2)细胞倍增时间不一致，同一时间收获的细胞虽然表型一致，但不同组织块间爬出的细胞至收获时增殖代次和功能有差异，(3)随着传代次数增加，会降低整体细胞制剂的功能。目前仍缺乏可用于临床治疗用的脐带来源间充质干细胞的高效培养方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种人源脐带来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒及组织贴壁培养方法。本专利技术所述优化培养基能够保证MSC在多次传代扩增后仍能满足临床应用监管要求。
[0007]本专利技术提供了一种人源脐带来源间充质干细胞的优化培养基，所述优化培养基包括：基础培养基、血清替代物和补充剂；所述基础培养基包括DMEM
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low glucose和L
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谷氨酰胺；所述血清替代物包括Knockout
TM
血清替代物；所述补充剂包括重组人FGF2蛋白、重组人FGF4蛋白、重组人PDGF AB蛋白、重组人EGF蛋白、重组人VEGF蛋白、重组人HGF蛋白、重组人TGF
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beta 1、重组人BMP
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3蛋白和烟酰胺单核苷酸。
[0008]优选的是，所述优化培养基中，基础培养基、血清替代物和补充剂的体积比为90：9：1。
[0009]优选的是，所述优化培养基中：L
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谷氨酰胺的物质的量浓度为6mM，重组人FGF2蛋白的质量浓度为40ng/mL、重组人FGF4蛋白的质量浓度为10ng/mL、重组人PDGFAB蛋白的质量浓度为4ng/mL、重组人EGF蛋白的质量浓度为2ng/mL、重组人VEGF蛋白的质量浓度为0.2ng/mL、重组人HGF蛋白的质量浓度为0.2ng/mL、重组人TGF
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beta 1的质量浓度为0.5ng/mL、重组人BMP
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3蛋白的质量浓度为0.2ng/mL、烟酰胺单核苷酸的物质的量浓度为5mM。
[0010]本专利技术还提供了一种培养人源脐带来源间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的优化培养基、TrypLE
TM Express消化酶和Nunclon
TM Delta培养皿。
[0011]本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述试剂盒的人源脐带来源间充质干细胞的组织贴壁培养方法，包括以下步骤：
[0012]将脐带样本在TrypLE
TM Express消化酶溶液中进行消化，得到消化后的脐带组织；
[0013]将消化后的脐带组织在含上述技术方案所述优化培养基的Nunclon
TM Delta培养皿中进行贴壁培养，得到人源脐带来源间充质干细胞。
[0014]优选的是，所述脐带样本的来源包括：脐带胎盘连接处组织和/或脐带组织；所述脐带组织包括脐带衬里和/或脐带华通氏胶。
[0015]优选的是，所述消化的时间为5min。
[0016]优选的是，所述贴壁培养后还包括：待贴壁培养的细胞融合度达到70～90％时，使用TrypLE
TM Express消化酶溶液进行消化培养，离心，获得原代细胞。
[0017]优选的是，所述消化培养的时间为3～4min。
[0018]优选的是，将得到的原代细胞进行传代培养时，使用所述优化培养基进行培养。
[0019]本专利技术提供了一种人源脐带来源间充质干细胞的优化培养基。本专利技术所述培养基包括：基础培养基、血清替代物和补充剂。本专利技术所述优化培养基能够保证MSC在多次传代扩增后仍能保持其专一的细胞表型和多向分化潜能，最大限度地缩短细胞从组织内分离到适应体外培养环境过程的时间、最大限度地提高单位时间内的细胞产量，缩短代次培养间的时间，进而提高细胞性能并满足临床应用监管要求，可在体外更好的扩增人类间充质干细胞，最大限度地提高MSC体外扩增效率并减少批次间细胞的差异。
附图说明
[0020]图1为本专利技术提供的脐带采集部分示意图；
[0021]图2为本专利技术提供的脐带解剖示意图；
[0022]图3为本专利技术提供的组织贴壁接种示意图；
[0023]图4为本专利技术提供的CPJ/WJ/CL组织在Day6/12/18时间点细胞爬出状态对比；
[0024]图5为本专利技术提供的UCMSC21041101脐带来源间充质干细胞P1代细胞制备(10瓶)；
[0025]图6为本专利技术提供的显示UCMSC21042101脐带来源间充质干细胞P1代细胞制备(20瓶)；
[0026]图7为本专利技术提供的显示UCMSC21062101脐带来源间充质干细胞P1代细胞制备(30瓶)；
[0027]图8为本专利技术提供的不同条件下脐带WJ组织间充质细胞爬出状态；
[0028]图9为本专利技术提供的中科UC
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MSC优化培养基组合及达科为MSC培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源脐带来源间充质干细胞的优化培养基，其特征在于，所述优化培养基包括：基础培养基、血清替代物和补充剂；所述基础培养基包括DMEM
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low glucose和L
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谷氨酰胺；所述血清替代物包括Knockout
TM
血清替代物；所述补充剂包括重组人FGF2蛋白、重组人FGF4蛋白、重组人PDGF AB蛋白、重组人EGF蛋白、重组人VEGF蛋白、重组人HGF蛋白、重组人TGF
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beta 1、重组人BMP
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3蛋白和烟酰胺单核苷酸。2.根据权利要求1所述的优化培养基，其特征在于，所述优化培养基中，基础培养基、血清替代物和补充剂的体积比为90：9：1。3.根据权利要求1所述的优化培养基，其特征在于，所述优化培养基中：L
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谷氨酰胺的物质的量浓度为6mM，重组人FGF2蛋白的质量浓度为40ng/mL、重组人FGF4蛋白的质量浓度为10ng/mL、重组人PDGF AB蛋白的质量浓度为4ng/mL、重组人EGF蛋白的质量浓度为2ng/mL、重组人VEGF蛋白的质量浓度为0.2ng/mL、重组人HGF蛋白的质量浓度为0.2ng/mL、重组人TGF
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beta 1的质量浓度为0.5ng/mL、重组人BMP
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3蛋白的质量浓度为0.2ng/mL、烟酰胺单核苷酸的物质的量浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：金倞，雷欣华，梁磊，
申请(专利权)人：北京吉中科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：