一种外泌体的分离提取方法技术

本发明专利技术公开了一种外泌体的分离提取方法，该方法是将含外泌体的液体样品用孔径0.45nm的超滤膜进行过滤，所得滤液过多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂柱，外泌体被多聚赖氨酸吸附，其他杂蛋白、脂类、盐从柱子穿过，通过洗脱液进行洗脱得到粗提的外泌体溶液；粗提的外泌体溶液再经过CD63

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体的分离提取方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种外泌体的分离提取方法。

技术介绍

[0002]外泌体(Exosomes)是细胞所分泌的直径为30～150nm，密度在1.13～1.21g/mL的双层磷脂囊泡，通常情况下是以胞吐形式释放到细胞外环境。其表面含有和功能相关的蛋白质和脂质成分，其膜表面表达特异性的蛋白质如CD9、CD63、CD81、TSC101和HSP70等，内部包裹了供体来源的蛋白质、核酸等活性物质。当外泌体和靶细胞接触后，其携带的生物分子以胞吞的形式被接收，在靶细胞中释放出来并发挥作用。近年来，随着对外泌体研究的进一步加深，发现不同组织细胞来源的外泌体呈现组织细胞的特异性，能够携带来源细胞的生物活性蛋白质、脂质、核酸等；在机体生理和病理状态下，外泌体内含的物质会随着细胞环境的变化而发生变化，因此，外泌体诊断在临床应用中越来越被重视。
[0003]外泌体能够在细胞间穿梭，有利于细胞间物质和信息的交换，通过装载外来药物来改变受体细胞的功能和状态，实现靶向治疗的目的。外泌体作为装载的工具，能够携带各种类型的药物，到达体内的各个系统，在神经系统疾病中，药物很难通过血脑屏障进入到靶细胞发挥作用，而外泌体可以通过实现对疾病的治疗。
[0004]外泌体的提取主要有以下几种方式：(1)超速离心法，是目前的金标准方法，此种方法采用低速离心高速离心交替进行分离外泌体，纯度高，但综合产量不高；(2)密度梯度离心法，使外泌体聚集在特定的密度阶层，纯度高，综合产量较好，但操作繁琐；(3)超滤离心法，利用不同截留相对分子质量的超滤膜对样品进行分离，此方法比较粗糙，操作简单；(4)磁珠免疫法，用包被抗标记物的磁珠分离外泌体，这种方法特异性较高，标记物标记的抗体较难拿到，有严格的要求。现在虽然有不同的外泌体提取方法，但均无法解决规模化提取的问题，常用的超速离心法一次离心的液体量有限；超滤法可以上规模但纯度有限；凝胶柱可以达到纯化效果但一次上样量有限。这些提取方法各有优缺点，多数方法只能做到小批量提取，能够做到大规模提取的，目前还没有一种很有效的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种可实现大规模高纯度提取外泌体的方法，整个操作过程不需要离心机，操作过程简单，只经过一次超滤膜过滤，过一次凝胶、一次色谱柱就可实现大规模提取，且整个实验过程中没有使用化学性质强的试剂和剧烈的反应，过程温和没有造成对所提外泌体结构性质的影响，提取的外泌体结构完整、性质稳定，能够实现对各种外泌体的提取。
[0006]针对上述目的，本专利技术采用的外泌体的分离提取方法包括下述步骤组成：
[0007]1、将含外泌体的液体样品用孔径0.45nm的超滤膜进行过滤，收集滤液；
[0008]2、将步骤1收集的滤液穿过多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂柱，再用洗脱液洗脱树脂柱，收集粗提的外泌体溶液；其中，所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是将含
‑
COOH或
‑
NH2的阳离子树脂直接和多聚赖氨酸连接获得或者将含
‑
OH或
‑
COOH或
‑
NH2的阳离子树脂通过Linker和多聚赖氨酸连接获得；所述洗脱液为3～6mol/L尿素溶液、3～6mol/L盐酸胍溶液、3～6mol/L异硫氰酸胍溶液中任意一种；
[0009]3、将粗提的外泌体溶液穿过CD63
‑
CNBr
‑
Sepharose 4B层析柱或CD81
‑
CNBr
‑
Sepharose 4B层析柱或CD9
‑
CNBr
‑
Sepharose 4B层析柱，再用盐酸
‑
甘氨酸洗脱层析柱，对外泌体进行进一步的精提；
[0010]4、将精提的外泌体溶液和PBS缓冲液等体积混合，然后用100KD孔径的超滤膜超滤，此过程重复3～5次，得到纯度95％以上的外泌体。
[0011]上述步骤1中，所述含外泌体的液体样品为牛奶、羊奶、人乳、细胞培养上清、尿液、血清中任意一种。
[0012]进一步优选，上述步骤2中，先用1.5～2倍柱体积的20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液平衡树脂柱，待电导及紫外吸收值稳定后，将步骤1收集的滤液进行上样，上样量为1.5～2个柱体积，上样速度为0.5～3mL/分钟，上样结束后静置5～10分钟，用1～2个柱体积的20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液再次平衡树脂柱；基线稳定后，用1个柱体积的洗脱液洗脱树脂柱，然后静置5～10分钟，继续用洗脱液洗脱树脂柱，收集粗提的外泌体溶液。
[0013]上述步骤2中，所述含
‑
COOH的阳离子树脂为羧基化硅胶、羧基化琼脂糖、羧基化葡聚糖中任意一种；所述含
‑
NH2的阳离子树脂为氨基化硅胶、氨基化琼脂糖、氨基化葡聚糖中任意一种；所述含
‑
OH的阳离子树脂为羟基化硅胶、羟基化琼脂糖、羟基化葡聚糖中任意一种。
[0014]上述步骤2中，所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是在缩合剂、添加剂的作用下，将含
‑
COOH的阳离子树脂与多聚赖氨酸的
‑
NH2通过缩合反应或含
‑
NH2的阳离子树脂与多聚赖氨酸的
‑
COOH通过缩合反应获得。或者所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是：在缩合剂、添加剂的作用下，将含
‑
OH或
‑
NH2的阳离子树脂与两端均为
‑
COOH或一端为
‑
COOH、另一端为
‑
OH或
‑
NH2的Linker上一端的
‑
COOH进行缩合反应后，再将多聚赖氨酸的
‑
NH2与Linker上另一端的
‑
COOH进行缩合反应或多聚赖氨酸的
‑
COOH与Linker上另一端的
‑
OH或
‑
NH2进行缩合反应，得到多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂。或者所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是：在缩合剂、添加剂的作用下，将含
‑
COOH的阳离子树脂与两端均为
‑
OH或两端均为NH2或一端为
‑
OH、另一端为
‑
NH2的Linker上一端的
‑
OH或NH2进行缩合反应后，再将多聚赖氨酸的
‑
COOH与Linker上另一端的
‑
OH或
‑
NH2进行缩合反应，得到多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂。
[0015]上述两端均为
‑
COOH的Linker为HOOC
‑
CH2‑
CH2‑
CH2‑
COOH，所述一端为
‑
COOH、另一端为
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体的分离提取方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤组成：(1)将含外泌体的液体样品用孔径0.45nm的超滤膜进行过滤，收集滤液；(2)将步骤(1)收集的滤液穿过多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂柱，再用洗脱液洗脱树脂柱，收集粗提的外泌体溶液；所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是将含
‑
COOH或
‑
NH2的阳离子树脂直接和多聚赖氨酸连接获得或者将含
‑
OH或
‑
COOH或
‑
NH2的阳离子树脂通过Linker和多聚赖氨酸连接获得；所述洗脱液为3～6mol/L尿素溶液、3～6mol/L盐酸胍溶液、3～6mol/L异硫氰酸胍溶液中任意一种；(3)将粗提的外泌体溶液穿过CD63
‑
CNBr
‑
Sepharose 4B层析柱或CD81
‑
CNBr
‑
Sepharose 4B层析柱或CD9
‑
CNBr
‑
Sepharose 4B层析柱，再用盐酸
‑
甘氨酸洗脱层析柱，对外泌体进行进一步的精提；(4)将精提的外泌体溶液和PBS缓冲液等体积混合，然后用100KD孔径的超滤膜超滤，此过程重复3～5次，得到纯度95％以上的外泌体。2.根据权利要求1所述的外泌体的分离提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述含外泌体的液体样品为牛奶、羊奶、人乳、细胞培养上清、尿液、血清中任意一种。3.根据权利要求1所述的外泌体的分离提取方法，其特征在于，步骤(2)中，先用1.5～2倍柱体积的20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液平衡树脂柱，待电导及紫外吸收值稳定后，将步骤(1)收集的滤液进行上样，上样量为1.5～2个柱体积，上样速度为0.5～3mL/分钟，上样结束后静置5～10分钟，用1～2个柱体积的20mmol/L pH＝7.35的PBS缓冲液再次平衡树脂柱；基线稳定后，用1个柱体积的洗脱液洗脱树脂柱，然后静置5～10分钟，继续用洗脱液洗脱树脂柱，收集粗提的外泌体溶液。4.根据权利要求1所述的外泌体的分离提取方法，其特征在于，所述含
‑
COOH的阳离子树脂为羧基化硅胶、羧基化琼脂糖、羧基化葡聚糖中任意一种；所述含
‑
NH2的阳离子树脂为氨基化硅胶、氨基化琼脂糖、氨基化葡聚糖中任意一种；所述含
‑
OH的阳离子树脂为羟基化硅胶、羟基化琼脂糖、羟基化葡聚糖中任意一种。5.根据权利要求4所述的外泌体的分离提取方法，其特征在于，所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是在缩合剂、添加剂的作用下，将含
‑
COOH的阳离子树脂与多聚赖氨酸的
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NH2通过缩合反应或含
‑
NH2的阳离子树脂与多聚赖氨酸的
‑
COOH通过缩合反应获得。6.根据权利要求5所述的外泌体的分离提取方法，其特征在于，所述多聚赖氨酸修饰的阳离子树脂是：在缩合剂、添加剂的作用下，将含
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OH或
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NH2的阳离子树脂与两端均为
‑
CO...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鑫，王瑞莉，张忠旗，翟江华，李元，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：