一种子宫内膜间充质干细胞分离、纯化及扩增试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种子宫内膜间充质干细胞的快速高效分离、纯化及扩增试剂盒及其应用。试剂盒由子宫内膜组织消化液、子宫内膜间质细胞培养试剂及子宫内膜间充质干细胞培养试剂组成。子宫内膜组织消化液包括：Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、DNAase I及DMEM/F12基础培养基。子宫内膜间质细胞培养试剂包括：胎牛血清、TGF

【技术实现步骤摘要】
一种子宫内膜间充质干细胞分离、纯化及扩增试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种子宫内膜间充质干细胞的快速高效分离、纯化及扩增试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]人类子宫内膜是一种高度动态的组织，具有在育龄期循环再生的能力，这与子宫内膜组织中存在子宫内膜干细胞(endometrium stem cells，EnSCs)密切相关。研究发现EnSC主要是由一群上皮干细胞(epithelial stem cells，EpSCs)、子宫内膜间充质干细胞(endometrium mesenchymal stem cells，eMSCs)和侧群干细胞(side population stem cells，SPSCs)组成。其中，eMSCs作为再生医学理想的种子细胞具有获取简便、分泌多种促细胞增殖和血管生成等相关因子的特性，具有潜在的促进子宫内膜生长和恢复女性生殖功能的作用。为干细胞移植治疗疾病，尤其是女性生殖领域疾病的治疗创造了较好的前提条件。此外eMSCs还可以作为免疫调节剂以减轻炎症，影响组织再生中血管的生成，也能诱导成为多能干细胞；eMSCs具有分化成平滑肌细胞的能力，已被尝试应用于膀胱壁的重建。另外，有研究将eMSCs和骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)分别移植到心肌梗死的心脏内，可以观察到移植eMSCs的心脏梗死面积更小。以上数据都展示了eMSCs较其他干细胞在临床应用中具有更大的优越性和潜力。
[0003]eMSCs作为一个极具吸引力的干细胞再生治疗来源，其主要优势是可非侵入性获得(通过无创活检内膜组织或收集经期经血)和体外显著分化能力，是一种非常稳定的自体干细胞来源，且其相对于其他来源干细胞更易于体外扩展。研究表明eMSCs主要分布在子宫内膜功能层和基底层的血管周围，并且血管周围的Sushi domain containing 2(SUSD2)蛋白可以作为eMSCs鉴定的分子标志物。目前eMSCs分离纯化方式主要包括：克隆纯化法和基于SUSD2蛋白标签的流式细胞分选或磁珠分选。克隆纯化法具体来说，首先是采用机械剪切和胶原酶消化相结合的方法分离子宫内膜间质细胞(包含子宫内膜基质细胞、子宫内膜间充质干细胞)，再利用单克隆环法进一步纯化eMSCs，该方法分离过程中不需要依赖大型流式细胞分选仪或磁珠分选设备，对设备要求比较低，不同地域开展性较强，但是具有获得eMSCs纯度低、eMSCs纯化周期长等显著缺点。基于SUSD2蛋白标签的流式细胞仪分选或磁珠分选仍是目前eMSCs的主流分离方法，该方法具有获得eMSCs纯度高的明显优点，整个制备周期相对克隆纯化法有所短，但是仍然需要长达20
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30天左右才能获得1
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106个eMSCs(不同个体来源所需时间略有差异)。
[0004]总体而言，现有的eMSCs分离、纯化及扩增效率低下，该客观问题仍然是限制eMSCs大规模开展临床应用的技术瓶颈之一，如何高效分离、纯化及扩增eMSCs成为该领域关注重点，建立高效的eMSCs分离/扩增培养体系迫在眉睫，具有重要临床意义。若能优化现有eMSCs分离步骤/手段、培养或扩增体系并研制针对eMSCs高效分离、纯化及扩增的试剂盒，将促使eMSCs从基础研究向临床应用转化，同时也将为基于eMSCs开展的再生医学行业现状
带来一次有力的推动。

技术实现思路

[0005]解决的技术问题
[0006]本专利技术的解决的问题是提供一种高效分离、纯化及扩增eMSCs的培养体系，并将其制备成试剂盒、具体应用在基础科研和临床转化医学领域。
[0007]采用的技术方案
[0008]一种子宫内膜间充质干细胞分离、纯化及扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由子宫内膜组织消化液、子宫内膜间质细胞培养试剂及子宫内膜间充质干细胞培养试剂组成。
[0009]进一步，所述子宫内膜组织消化液包括：Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、DNAase I及DMEM/F12基础培养基。
[0010]进一步，所述子宫内膜间质细胞培养试剂包括：胎牛血清、TGF
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βI型受体抑制剂、抗生素及DMEM/F12基础培养基。
[0011]进一步，所述子宫内膜间充质干细胞培养试剂包括：间充质干细胞用胎牛血清、TGF
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βI型受体抑制剂、抗生素及DMEM/F12基础培养基。
[0012]更进一步，如前所述的任意一种子宫内膜间充质干细胞高效分离、纯化及扩增试剂盒在基础研究和临床转化医学中的应用。
[0013]具体来说：
[0014]首先是采用机械剪切和混合型胶原酶消化相结合的方法将子宫内膜组织解离为单细胞悬液，依次过100/200/400目筛网，收集滤液并离心，随后弃上清，使用含有胎牛血清、TGF
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βI型受体抑制剂及抗生素的DMEM/F12培养基培养，待细胞生长汇合后使用SUSD2抗体进行磁珠分选，分选后的SUSD2阳性细胞使用含有间充质干细胞用胎牛血清、TGF
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βI型受体抑制剂及抗生素的DMEM/F12培养基扩增培养。
[0015]所述eMSCs分离、纯化及扩增试剂盒包含子宫内膜组织消化液、子宫内膜间质细胞培养试剂及子宫内膜间充质干细胞培养试剂。子宫内膜组织消化液包括：Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、DNAaseⅠ及DMEM/F12基础培养基；子宫内膜间质细胞培养试剂包括：胎牛血清、TGF
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βI型受体抑制剂、抗生素及DMEM/F12基础培养基；子宫内膜间充质干细胞培养试剂包括：间充质干细胞用胎牛血清、TGF
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βI型受体抑制剂、抗生素及DMEM/F12基础培养基。
[0016]有益效果
[0017]本专利技术提供的一种eMSCs分离、纯化及扩增试剂盒的优越性在于：
[0018]本专利技术提供的eMSCs分离、纯化及扩增试剂盒，区别于传统的eMSCs制备方法，主要在子宫内膜间质细胞培培养阶段和磁珠分选后eMSCs扩增培养阶段都分别添加了TGF
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βI型受体抑制剂，使得eMSCs分离、纯化及扩增效率大大提高。该试剂盒的成功开发将为围绕eMSCs有关基础科研的开展提供极大便利，更有助于eMSCs临床研究和转化应用开展。
附图说明
[0019]图1原代培养第4、8及12天后明场视野观察并拍照。
[0020]图2原代培养第12天后结晶紫染色分析细胞克隆形成情况。
[0021]图3原代培养第12天后SUSD2+eMSCs富集比例分析。
[0022]图4磁珠分选SUSD2+eMSCs扩增培养后细胞表面marker表达分析。
[0023]图5本专利技术技术方案的原理流程图。
具体实施方式
[0024]本专利技术实施例的整体原理及改进点参见图5。
[0025]1.子宫内膜组织标本纳入标准本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种子宫内膜间充质干细胞分离、纯化及扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由子宫内膜组织消化液、子宫内膜间质细胞培养试剂及子宫内膜间充质干细胞培养试剂组成。2.如权利要求1所述的一种子宫内膜间充质干细胞分离、纯化及扩增试剂盒，其特征在于，所述子宫内膜组织消化液包括：Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、DNAaseⅠ及DMEM/F12基础培养基。3.如权利要求2所述的一种子宫内膜间充质干细胞分离、纯化及扩增试剂盒，其特征在于，所述子宫内膜间质细胞培养试剂包括：胎牛血清、T...

【专利技术属性】
技术研发人员：桂涛，万贵平，王智慧，曹美灵，曹剑，夏舒羽，甘霖，陈慧娴，周文娟，马洁桦，黄美华，成臣，吴文锦，王金丹，魏鑫俊，
申请(专利权)人：江苏省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：