一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒及培养方法技术

本发明专利技术提供了一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒及培养方法，涉及细胞培养技术领域。本发明专利技术所述试剂盒提供了全套无血清的试剂，可保证人嗅黏膜间充质干细胞全程无血清分离纯化、培养扩增、储存与复苏。本方法采用全程无血清方法处理人嗅黏膜间充质干细胞，在形态、纯度以及分化能力上与10％胎牛血清培养的人嗅黏膜间充质干细胞无明显差异。人嗅黏膜间充质干细胞无明显差异。人嗅黏膜间充质干细胞无明显差异。

【技术实现步骤摘要】
一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒及培养方法


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒及培养方法。

技术介绍

[0002]1998年Huard等人从人嗅黏膜中分离培养出一种可以向神经元与非神经细胞分化的细胞，后续被认为是嗅黏膜间充质干细胞(OM
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MSCs)。OM
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MSCs广泛存在于鼻中隔或侧壁的上、中、下鼻甲的鼻黏膜的固有层内。多项研究证实，该细胞不仅具有其他类型间充质干细胞的基本特性，并且相比于其他类型的间充质干细胞，OM
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MSCs具有取材方便，来源稳定，更容易向神经元及其他神经细胞分化的优势。OM
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MSCs在组织工程，再生医学和细胞免疫治疗领域具有广阔的应用前景。然而，目前培养OM
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MSCs的方法多用自体血清及胎牛血清作为营养来源，若将培养的细胞应用于人体，其风险极大，如：朊病毒感染、人体抗牛血清蛋白抗体的产生等。因此，迫切需要一种全程无血清的培养OM
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MSCs的方法减少疾病传播的风险，并能保持干细胞纯度，增殖及分化能力。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒及培养方法，全程无血清培养条件下处理的OM
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MSCs仍能维持干细胞的增殖和分化能力。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒，包括独立包装的无血清培养基、无血清胰酶终止液和无血清冻存液；
[0006]所述无血清培养基以DMEM/F12为基础培养基，还包括谷氨酰胺600μg/mL、HEPES 2nM、丙酮酸钠60μg/mL、层粘蛋白50μg/mL、氢化可的松1μg/mL、人重组白蛋白1mg/mL、重组人胰岛素20μg/mL、重组人转铁蛋白0.5ng/mL、β
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甘油磷酸4mg/mL、胆固醇5μg/mL、生物素20μg/mL、肝素钠4IU/mL、维生素B1210μg/mL、维生素E10μg/mL、维生素C 50μg/mL、干细胞营养液(v/v)5％、成纤维细胞生长因子20ng/mL、GM
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CSF 10ng/mL、EGF 20ng/mL和β
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FGF 20ng/mL；
[0007]所述无血清胰酶终止液包括PBS缓冲液和抑肽酶溶液20μg/mL；
[0008]所述无血清冻存液包括以下体积百分含量的组分：DMSO 10％、白蛋白溶液30％、右旋糖酐40葡萄糖注射液20％、复方电解质注射液20％和葡萄糖氯化钠注射液20％。
[0009]本专利技术提供了一种人嗅黏膜充间质干细胞的培养方法，包括以下步骤：将采集的人嗅黏膜样本清洗后剪碎，与上述试剂盒中的无血清培养基混合培养，纯化出人嗅黏膜充间质干细胞，得P0代细胞；
[0010]将P0代细胞培养至70～80％融合度时，用胰酶消化，利用上述试剂盒中的无血清胰酶终止液终止，离心后用所述无血清培养基重悬沉淀，得P1代细胞；利用所述P1代细胞进行与P1代相同的操作，进行代数扩增；
[0011]将获得的P0代至P4代的细胞在所述离心后，利用上述试剂盒中的无血清冻存液进行重悬，而后进行冻存。
[0012]优选的，所述人嗅黏膜样本采集自上鼻甲及中鼻甲靠上部外侧黏膜组织。
[0013]优选的，所述清洗包括将采集的嗅黏膜样本用青霉素和生理盐水的混合溶液清洗3遍；所述青霉素和生理盐水的体积比为1:1。
[0014]优选的，采用组织块反复重新贴壁的方法纯化出人嗅黏膜充间质干细胞；
[0015]在纯化出所述人嗅黏膜充间质干细胞后，还包括每3天更换一次所述无血清培养基。
[0016]优选的，所述冻存包括，依次经4℃冷藏1h，
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20℃冷冻4h，转移至液氮上层，8～12h后转移至液氮下层。
[0017]优选的，对经所述冻存后的人嗅黏膜充间质干细胞进行复苏，包括：采用37℃水浴复温，融化的细胞悬液与所述无血清培养基混合，离心收集沉淀，用无血清冻存液重悬。
[0018]优选的，所述离心的转速为1000rpm，时间为5min。
[0019]本专利技术还提供了利用上述培养方法培养得到的人嗅黏膜充间质干细胞在获得成骨、成脂或成软骨细胞中的应用。
[0020]有益效果：本专利技术提供了一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒，包括独立包装的无血清培养基、无血清胰酶终止液和无血清冻存液，使得OM
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MSCs在分离纯化、培养扩增、储存与复苏全程无血清。利用本专利技术所述试剂盒，在OM
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MSCs的分离纯化、培养扩增、储存与复苏全过程中，优化操作步骤，简化培养流程，可获得纯度更高的OM
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MSCs。本专利技术自获取鼻黏膜后全程不涉及自体血清或胎牛血清，使用了化学成分明确的无血清培养基，避免了疾病的传播。应用该无血清培养基与10％FBS培养基在形态上相似，均呈梭形，螺旋状生长，并具有间充质干细胞的增殖能力。流式细胞仪对OM
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MSC的表面标志物检测显示与10％FBS培养一致。无血清培养的细胞高表达间充质干细胞标志物(CD73，CD90，CD105)以及OM
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MSCs的特殊标志物，不表达造血干细胞标志物(CD34，CD45)。并且无血清培养OM
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MSCs在成脂和成骨能力上与10％FBS培养的OM
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MSCs相近。综上可见，无血清培养的细胞符合OM
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MSC鉴定标准，与10％FBS培养的OM
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MSC在形态，生长方式，细胞表型，分化能力等方面一致，全程无血清培养方法可用于OM
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MSC培养，实现OM
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MSCs的体外大量扩增，对未来的临床应用意义重大。
附图说明
[0021]图1为10％血清与无血清培养P4代OM
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MSC形态对比；
[0022]图2为10％血清与无血清培养P4代OM
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MSC流式表型对比；
[0023]图3为10％血清与无血清培养P4代OM
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MSC的诱导分化结果对比。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒，包括独立包装的无血清培养基、无血清胰酶终止液和无血清冻存液；
[0025]所述无血清培养基以DMEM/F12为基础培养基，还包括谷氨酰胺600μg/mL、HEPES 2nM、丙酮酸钠60μg/mL、层粘蛋白50μg/mL、氢化可的松1μg/mL、人重组白蛋白1mg/mL、重组
人胰岛素20μg/mL、重组人转铁蛋白0.5ng/mL、β
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甘油磷酸4mg/mL、胆固醇5μg/mL、生物素20μg/mL、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，包括独立包装的无血清培养基、无血清胰酶终止液和无血清冻存液；所述无血清培养基以DMEM/F12为基础培养基，还包括谷氨酰胺600μg/mL、HEPES 2nM、丙酮酸钠60μg/mL、层粘蛋白50μg/mL、氢化可的松1μg/mL、人重组白蛋白1mg/mL、重组人胰岛素20μg/mL、重组人转铁蛋白0.5ng/mL、β
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甘油磷酸4mg/mL、胆固醇5μg/mL、生物素20μg/mL、肝素钠4IU/mL、维生素B1210μg/mL、维生素E10μg/mL、维生素C 50μg/mL、体积百分含量为5％的干细胞营养液、成纤维细胞生长因子20ng/mL、GM
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CSF 10ng/mL、EGF 20ng/mL和β
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FGF 20ng/mL；所述无血清胰酶终止液包括PBS缓冲液和抑肽酶溶液20μg/mL；所述无血清冻存液包括以下体积百分含量的成分：DMSO 10％、白蛋白溶液30％、右旋糖酐40葡萄糖注射液20％、复方电解质注射液20％和葡萄糖氯化钠注射液20％。2.一种人嗅黏膜充间质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将采集的人嗅黏膜样本清洗后剪碎，与权利要求1所述试剂盒中的无血清培养基混合培养，纯化出人嗅黏膜充间质干细胞，得P0代细胞；将P0代细胞培养至70～80％融合度时，用胰酶消化，利...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢明，李文水，段答，刘钰，胡莉，
申请(专利权)人：卢明，
类型：发明
国别省市：