一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：S1、取原代人脐带间充质干细胞按3000个/mL的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于饱和湿度培养箱中培养，每隔3d进行全量换液，待原代人脐带间充质干细胞生长至80％融合时，使用重组酶消化后进行传代培养，传至P5代。本发明专利技术低氧培养人脐带间充质干细胞的方法对间充质干细胞的培养效果更好，培养后的间充质干细胞的增殖倍数和细胞活率都更优于常氧培养；羧甲基纤维素钠、丝素蛋白，可提高细胞的粘附性，利于细胞固着，促进细胞生长；大豆低聚肽和辅酶Q10具有较好的抗氧化作用，促进细胞代谢，提高细胞内酶的活性。高细胞内酶的活性。

【技术实现步骤摘要】
一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的组织类型十分广泛，因此临床应用价值不菲。
[0003]现有的无血清低氧培养后的间充质干细胞的增殖倍数和细胞活率均较低，限制了无血清低氧培养效率，基于此，本专利技术提供一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的是提供一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]本专利技术解决技术问题采用如下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
[0007]S1、取原代人脐带间充质干细胞按3000个/mL的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于饱和湿度培养箱中培养，每隔3d进行全量换液，待原代人脐带间充质干细胞生长至80％融合时，使用重组酶消化后进行传代培养，传至P5代；
[0008]S2、收集P5代细胞进行流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞高表达CD105、CD90、CD73；CD34、CD45和HLA
‑
DR的表达量低于0.05％，表明培养的细胞具有间充质干细胞的基本特征。
[0009]优选地，所述培养皿由基础培养基、添加剂成分组成。
[0010]优选地，所述基础培养基成分包括以下重量份原料：
[0011]无水氯化钙200mg/L、硝酸铁9H2O 0.1mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400mg/L、无水磷酸二氢钠125mg/L、L
‑
盐酸精氨酸84mg/L、L
‑
盐酸胱氨酸63mg/L、L
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谷氨酰胺584mg/L、甘氨酸30mg/L、L
‑
盐酸组氨酸42mg/L、L
‑
异亮氨酸105mg/L、L
‑
亮氨酸105mg/L、L
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盐酸赖氨酸146mg/L、L
‑
甲硫氨酸30mg/L、L
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苯丙胺酸66mg/L、L
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丝氨酸42mg/L、L
‑
苏氨酸95mg/L、L
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色氨酸16mg/L、L
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酪氨酸钠盐104mg/L、L
‑
缬氨酸94mg/L、D
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泛酸钙4mg/L、氯化胆碱4mg/L、叶酸4mg/L、肌醇7.2mg/L、烟酰胺4mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺4mg/L、盐酸吡哆辛4mg/L、葡萄糖1000mg/L、丙酮酸钠110mg/L。
[0012]优选地，所述添加剂成分包括以下重量份原料：
[0013]1‑
3％血小板裂解物、1
‑
3％人血白蛋白、1
‑
3μg/ml重组胰岛素、10
‑
20ng/ml EGF、10
‑
20ng/ml bFGF、丝素蛋白0.0075
‑
0.0085mg/L、羧甲基纤维素钠0.005
‑
0.006mg/L、大豆低聚肽0.010
‑
0.012mg/L、3
‑
吡啶甲酸0.0135
‑
0.0140mg/L、辅酶Q10 0.01
‑
0.02mg/L、α
‑
酮
戊二酸0.0085
‑
0.0090mg/L、微量元素0.025
‑
0.030mg/L。
[0014]优选地，所述添加剂成分包括以下重量份原料：
[0015]1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml EGF、15ng/ml bFGF、丝素蛋白0.0085mg/L、羧甲基纤维素钠0.006mg/L、大豆低聚肽0.012mg/L、3
‑
吡啶甲酸0.0135mg/L、辅酶Q10 0.01mg/L、α
‑
酮戊二酸0.0085mg/L、微量元素0.025mg/L。
[0016]优选地，所述微量元素为镁、铁、锌、硒中的一种或多种组合物。
[0017]优选地，所述饱和湿度培养箱的条件为：37℃，5％CO2的低氧培养条件。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
[0019]本专利技术低氧培养人脐带间充质干细胞的方法对间充质干细胞的培养效果更好，培养后的间充质干细胞的增殖倍数和细胞活率都更优于常氧培养；羧甲基纤维素钠、丝素蛋白，可提高细胞的粘附性，利于细胞固着，促进细胞生长；大豆低聚肽和辅酶Q10具有较好的抗氧化作用，促进细胞代谢，提高细胞内酶的活性，α
‑
酮戊二酸和3
‑
吡啶甲酸协同作用，调节蛋白质的代谢，促进蛋白的合成，提高细胞生长速度和增殖数量，提高细胞分泌生长因子的性能；微量元素提供更好的营养环境，进一步促进细胞生长，提高细胞活性。
具体实施方式
[0020]下面结合具体实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0021]本实施例的一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
[0022]S1、取原代人脐带间充质干细胞按3000个/mL的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于饱和湿度培养箱中培养，每隔3d进行全量换液，待原代人脐带间充质干细胞生长至80％融合时，使用重组酶消化后进行传代培养，传至P5代；
[0023]S2、收集P5代细胞进行流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞高表达CD105、CD90、CD73；CD34、CD45和HLA
‑
DR的表达量低于0.05％，表明培养的细胞具有间充质干细胞的基本特征。
[0024]本实施例的培养皿由基础培养基、添加剂成分组成。
[0025]本实施例的基础培养基成分包括以下重量份原料：
[0026]无水氯化钙200mg/L、硝酸铁9H2O 0.1mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400mg/L、无水磷酸二氢钠125mg/L、L
‑
盐酸精氨酸84mg/L、L
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取原代人脐带间充质干细胞按3000个/mL的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于饱和湿度培养箱中培养，每隔3d进行全量换液，待原代人脐带间充质干细胞生长至80％融合时，使用重组酶消化后进行传代培养，传至P5代；S2、收集P5代细胞进行流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞高表达CD105、CD90、CD73；CD34、CD45和HLA
‑
DR的表达量低于0.05％，表明培养的细胞具有间充质干细胞的基本特征。2.根据权利要求1所述的一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，其特征在于，所述培养皿由基础培养基、添加剂成分组成。3.根据权利要求2所述的一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，其特征在于，所述基础培养基成分包括以下重量份原料：无水氯化钙200mg/L、硝酸铁9H2O 0.1mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400mg/L、无水磷酸二氢钠125mg/L、L
‑
盐酸精氨酸84mg/L、L
‑
盐酸胱氨酸63mg/L、L
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谷氨酰胺584mg/L、甘氨酸30mg/L、L
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盐酸组氨酸42mg/L、L
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异亮氨酸105mg/L、L
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亮氨酸105mg/L、L
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盐酸赖氨酸146mg/L、L
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甲硫氨酸30mg/L、L
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苯丙胺酸66mg/L、L
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丝氨酸42mg/L、L
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苏氨酸95mg/L、L
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色氨酸16mg/L、L
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酪氨酸钠盐104mg/L、L
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缬氨酸94mg/L、D
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泛酸钙4mg/L、氯化胆碱4mg/L、叶酸4mg/L、肌醇7.2mg/L、烟酰胺4mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺4mg/L、盐酸吡哆...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海波，赵彦松，侯立胜，倪志国，梅振宇，吴佳美，刘美琪，胡妍，
申请(专利权)人：内蒙古蒙科干细胞基因医学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：