一种异甜菊醇诱导干细胞分化的用途及含有异甜菊醇的干细胞诱导分化培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种异甜菊醇诱导干细胞分化的用途及含有异甜菊醇的干细胞诱导分化培养基。本发明专利技术研究结果表明，异甜菊醇具有诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用，同时还可以促进人骨髓间充质干细胞增殖，可以用作活性成分制备人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基。因此，请求保护异甜菊醇用于体外诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化的用途，以及含有异甜菊醇的人骨髓间充质干细胞诱导分化培养基。甜菊醇的人骨髓间充质干细胞诱导分化培养基。甜菊醇的人骨髓间充质干细胞诱导分化培养基。

【技术实现步骤摘要】
一种异甜菊醇诱导干细胞分化的用途及含有异甜菊醇的干细胞诱导分化培养基


[0001]本专利技术属于干细胞诱导分化领域，具体涉及一种异甜菊醇诱导干细胞分化的用途及含有异甜菊醇的干细胞诱导分化培养基。

技术介绍

[0002]骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种未充分分化的类中胚层细胞，在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、神经元等，由于其具有取材方便、对机体损伤小、免疫原性小等优点，已作为骨组织工程等组织工程学中重要的种子细胞被广泛应用于科研与临床。
[0003]目前检测BMSCs成骨分化主要通过茜素红染色法或者测定成骨分化标志物ALP、Runx2、OCN的表达量。茜素红染色法中，被染色的钙结节数量越多、面积越大，代表成骨分化越明显。成骨分化标志物ALP、Runx2、OCN的表达量越高，代表成骨分化越明显。
[0004]异甜菊醇(Isosteviol，IS)是一种四环二萜类化合物，具有广泛的生物的活性，比如：可以保护心肌细胞肥大，保护心肌损伤；能增强降糖效果进而治疗糖尿病；抗肿瘤活性。
[0005]异甜菊醇对人骨髓间充质干细胞诱导分化的影响尚没有报道。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种异甜菊醇诱导干细胞分化的用途及含有异甜菊醇的干细胞诱导分化培养基。
[0007]技术方案如下：
[0008]一种异甜菊醇用于体外诱导干细胞分化的用途；其中，所述干细胞为人骨髓间充质干细胞，所述分化指成骨分化。图3中A为Western blot结果，5μM、10μM组ALP、Runx2、OCN蛋白表达量明显高于0μM组，5μM、10μM组成骨分化标志物的表达量显著提高；图3中B为茜素红染色结果，5μM、10μM组染色面积、钙结节数量明显高于0μM组。图3结果说明5μM、10μM异甜菊醇有效促进了人骨髓间充质干细胞的成骨分化。
[0009]一种含有异甜菊醇的干细胞诱导分化培养基，所述干细胞为人骨髓间充质干细胞，所述分化指成骨分化。基于异甜菊醇具有促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用，异甜菊醇可以用作活性成分制备人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基。
[0010]上述干细胞诱导分化培养基用于体外诱导干细胞分化的用途；其中，所述干细胞为人骨髓间充质干细胞，所述分化指成骨分化。
[0011]技术效果如下：
[0012]本专利技术研究结果表明，异甜菊醇具有诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用，同时还可以促进人骨髓间充质干细胞增殖，可以用作活性成分制备人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基。因此，请求保护异甜菊醇用于体外诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化的用途，以及含有异甜菊醇的人骨髓间充质干细胞诱导分化培养基。
附图说明
[0013]图1为倒置显微镜下观察的细胞形态图。
[0014]图2为流式细胞术测定的细胞表型。
[0015]图3为Westernblot结果和茜素红染色结果。
具体实施方式
[0016]一、材料和试剂
[0017]人骨髓间充质干细胞(货号CP
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H166)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。人骨髓间充质干细胞完全培养基(货号CM
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H166)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基(货号PD
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014)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
[0018]FITC
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抗人CD34、FITC
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抗人CD45、PE
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抗人CD73、PE
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抗人CD90和PE
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抗人CD105购自美国Thermo Fisher公司。
[0019]异甜菊醇(IS)购自南京春秋生物工程有限公司，纯度98％。
[0020]Western blot法用到的试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。
[0021]二、方法
[0022]1、人骨髓间充质干细胞的培养和鉴定
[0023]按常规复苏方法将人骨髓间充质干细胞复苏后接种于75cm2细胞培养瓶中，用人骨髓间充质干细胞完全培养基于37℃、5％CO2条件下培养，待细胞融合度达80％，弃去原培养基，PBS缓冲液洗涤，胰酶消化成单细胞悬液，离心，人骨髓间充质干细胞完全培养基重悬，继续培养传代1次。将传代细胞消化重悬，取适量细胞接种于培养皿中，吉姆萨染色，倒置显微镜下观察、拍照；另取适量细胞用流式细胞术测定细胞表型，流式抗体为FITC
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抗人CD34、FITC
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抗人CD45、PE
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抗人CD73、PE
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抗人CD90和PE
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抗人CD105。
[0024]2、增殖活性检测
[0025]取状态良好的人骨髓间充质干细胞用人骨髓间充质干细胞完全培养基重悬后按照1
×
105个/100μL/孔接种于96孔板中，于37℃、5％CO2条件下培养12h后，每孔再加入100μL含不同浓度异甜菊醇的人骨髓间充质干细胞完全培养基，使得异甜菊醇的终浓度为5μM、10μM。同时设置不含有异甜菊醇的对照组，以及既不含有人骨髓间充质干细胞又不含有异甜菊醇的空白组。继续培养24h、48h后，于490nm波长下测定各孔的吸光度值(OD值)，根据公式计算不同浓度异甜菊醇培养不同时间后人骨髓间充质干细胞的增殖率：
[0026]增殖率(％)＝(IS组OD值
‑
空白组OD值)
÷
(对照组OD值
‑
空白组OD值)
×
100％。
[0027]3、Western blot检测成骨分化
[0028]取状态良好的人骨髓间充质干细胞用人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基重悬后按照5
×
104个/0.5mL/孔接种于24孔板中，于37℃、5％CO2条件下培养12h后，每孔再加入0.5mL含不同浓度异甜菊醇的人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，使得异甜菊醇的终浓度为0μM、5μM、10μM。继续培养48h后，收集细胞，裂解液裂解并提取蛋白，采用BCA方法测量蛋白浓度，分装后保存在
‑
20℃冰箱中待用。将5
×
SDS
‑
PAGE蛋白上样缓冲液与蛋白样品按照1:4的比例混匀，将蛋白样品置于沸水浴中加热10min使其变性，将处理好的样品加入分离胶的上样孔中，进行SDS
‑
PAGE电泳，转膜，加脱脂奶粉封闭1h，加入稀释的ALP、Runx2、OCN一抗孵育2h，PBS漂洗3次，加入二抗室温孵育1h，PBS漂洗3次，加入发光液后显影
曝光、拍照。内参为GAPDH。
[0029]4、茜素红染色检测成骨分化
[0030]取状态良好的人骨髓间充质干细胞用人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异甜菊醇用于体外诱导干细胞分化的用途；其中，所述干细胞为人骨髓间充质干细胞，所述分化指成骨分化。2.一种含有异甜菊醇的干细胞诱导分化培养基，所述干细胞为人骨髓间充...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ五一IntClC一二N五零七七五，
申请(专利权)人：溯玄上海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：