NADP-铁氧还蛋白还原酶突变体及其在生产谷氨酸中的应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及NADP

【技术实现步骤摘要】
NADP
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铁氧还蛋白还原酶突变体及其在生产谷氨酸中的应用


[0001]本专利技术涉及微生物与生物
，具体涉及一种NADP
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铁氧还蛋白还原酶突变体，以及该突变体构建L
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谷氨酸生产菌株，生产L
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谷氨酸的方法。

技术介绍

[0002]L
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谷氨酸作为必需氨基酸，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应，主要用于生产味精、鸡精等调味料以及各种食品，并在医药、化工、畜牧等领域应用广泛。
[0003]目前，L
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谷氨酸的生产主要通过微生物发酵法生产，其中最主要的生产菌株为谷氨酸棒杆菌。在谷氨酸棒杆菌中，主要由TCA循环的中间产物α
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酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的作用下生产L
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谷氨酸，合成路径较短，可用于改造菌株以便提升L
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谷氨酸产量的靶点也相对较少，因此，L
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谷氨酸生产菌株的性能提升受到较大限制。
[0004]NADP
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铁氧还蛋白还原酶，简称FprA，目前对该酶的报道较少，现有研究表明该酶是结核分枝杆菌的电子传递链蛋白，在电子传递中起主要的作用（Sabri, M, etal., Characterization of coenzyme binding and selectivity determinants in Mycobacterium tuberculosis flavoprotein reductase A: analysis of Arg(199) and Arg(200) Mutants at the NADP(H)2
’ꢀ‑
phosphate binding site.Biochemical Journal, 2009. 417: 103
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112.）；在铜绿假单胞菌中的研究表明，该基因可以受到LysR家族转录调节因子的调控（Boonma, S, etal.,The FinR
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regulated essential gene fprA, encoding ferredoxin NADP
(+) reductase: Roles in superoxide
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mediated stress protection and virulence of Pseudomonas aeruginosa.Plos One, 2017. 12(2): 21.）。而在谷氨酸棒杆菌中，目前仅对其进行了基因注释，被注释为假定蛋白或NADPH依赖型谷氨酸合酶β链及相关氧化还原酶，尚未有其他研究报道，其如何影响L
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谷氨酸的生产也尚不可知。

技术实现思路

[0005]现有技术报道NADP
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铁氧还蛋白还原酶是结核分枝杆菌的电子传递链蛋白，而电子传递对于细胞的生长和产物的合成至关重要，因此，我们推测该酶可能对菌株生产L
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谷氨酸有影响。本专利技术通过对该酶的过表达、或进行点突变、或进行点突变并转录表达增强可以提高菌株的谷氨酸产量，进而发现该酶的活性增强可以提升谷氨酸的生产效率，降低生产成本。在此基础上，完成本专利技术。
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种L
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谷氨酸的生产菌株，所述谷氨酸生产菌株中NADP
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铁氧还蛋白还原酶的活性增强，以提高所述菌株的L
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谷氨酸的产量和转化率。
[0007]可选地，所述活性增强是所述NADP
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铁氧还蛋白还原酶的转录表达增强，或SEQ ID NO：3所示序列的NADP
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铁氧还蛋白还原酶发生突变，或SEQ ID NO：3所示序列的NADP
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铁氧还蛋白还原酶发生突变且转录表达增强。
[0008]优选地，NADP
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铁氧还蛋白还原酶突变体为氨基酸序列在对应于SEQ ID NO：3所示序列的NADP
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铁氧还蛋白还原酶的第200位的丙氨酸被苏氨酸取代。
[0009]本专利技术的术语“活性增强”指的是通过修饰蛋白增强在微生物中蛋白质的细胞内活性，与以自然状态具备的蛋白质活性相比提高细胞内活性。不仅包括由于蛋白质自身活性的增加而带来的比原始功能更高的效果，而且其可以通过选自如下的至少一种方法进行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、将多核苷酸克隆到载体上引入微生物、对编码蛋白质的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质的活性、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性，也可以非限制性地包括任何已知的方法，只要与野生型相比能够增强蛋白质的活性或增强引入蛋白质的活性。调控序列包括能够起始转录的启动子，用于转录调控的任何操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合结构域的序列，调控转录和翻译终止的序列。对调控序列的修改包括但不限于，如：在多核苷酸序列中缺失、插入、保守突变或非保守突变、或其组合引入修改，也可以通过用具有增强活性的多核苷酸序列置换原始的多核苷酸序列。载体是包括编码靶蛋白编码核酸的多核苷酸序列的DNA构建体，其被可操作地链接至合适的调控序列以使靶蛋白可在宿主细胞中表达。载体在被转入合适的宿主细胞后可独立于宿主细胞基因组复制或起作用，或可以被整合到宿主的基因组上。这些载体可以不特别地限制，只要该载体在宿主细胞中是可复制的，并且其可以使用本领域已知的热河载体构建。载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pXMJ19、pWE15、pET、pUC载体等。另外，通过将载体插入到宿主细胞的染色体上，可以将染色体上编码内源靶蛋白的多核苷酸替换成为修饰的多核苷酸。
[0010]其中，本文所述的“NADP
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铁氧还蛋白还原酶”及其缩写名称“FprA”是指来源于谷氨酸棒杆菌，其在谷氨酸棒杆菌ATCC13869编码基因是Gene ID为BBD29_13460的蛋白。如本文所使用，FprA不被具体限制，只要其具有相应的活性，并且其可以是衍生自谷氨酸棒状杆菌，但是不限于此。例如，FprA可以是如SEQ ID NO:3的氨基酸序列的野生型序列或者与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的氨基酸序列。另外，如果氨基酸序列与上述序列具有同源性并且与SEQ ID NO:3的蛋白质具有基本上相同或相应的生物学活性，则具有缺失、修饰、置换或添加的氨基酸序列也应当属于本公开内容的范围是显而易见的。在本专利技术中，编码FprA的任何多核苷酸序列可以属于本公开内容的范围。例如，多核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产L
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谷氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述菌株中NADP
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铁氧还蛋白还原酶的活性增强，且所述菌株的L
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谷氨酸产量和转化率有所提高。2.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述活性增强是所述NADP
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铁氧还蛋白还原酶的转录表达增强，或SEQ ID NO：3所示序列的NADP
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铁氧还蛋白还原酶发生突变，或SEQ ID NO：3所示序列的NADP
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铁氧还蛋白还原酶发生突变且转录表达增强。3.如权利要求2所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述NADP
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铁氧还蛋白还原酶突变体为氨基酸序列在对应于SEQ ID NO：3所示序列的NADP
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铁氧还蛋白还原酶的第200位的丙氨酸被苏氨酸取代。4.如权利要求3所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述NADP
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铁氧还蛋白还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。5.如权利要求1
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4任一项所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，出发菌株选自谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，或由上述菌株制备的产生L
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谷氨酸的菌株。6.如权利要求5所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基础上，还包括选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：编码α
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酮戊二酸脱氢酶的odhA基因；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李广玉，郑平，周文娟，孙际宾，陈久洲，赵兰坤，蔡柠匀，张东旭，刘世周，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：