一种合成植物精油关键组分的重组菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种合成植物精油关键组分的重组菌及其构建方法与应用，该重组菌中含有外源基因；外源基因包括萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因；植物精油关键组分包括百里香酚和香芹酚。本发明专利技术通过导入萜类合成酶，细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因，成功地构建出一种可以合成百里香酚和香芹酚的重组菌，实现了百里香酚衍生物的异源合成。而且利用本发明专利技术的重组菌转化生产百里香酚和香芹酚，生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。的工业化应用前景。的工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种合成植物精油关键组分的重组菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体而言，涉及一种合成植物精油关键组分的重组菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]百里香酚又名麝香草酚，它主要来源于百里香属植物中，是百里香挥发油的主要组成成分，在香料领域,百里香酚具有特殊的香气,常用于配制各种香精,如柑桔、蘑菇香等。百里香酚不但广泛的应用在香料领域，又因为它具有防腐性，所以还可作为医疗药品，常出现在一些具有药用价值的卫生品中，如:牙膏、香皂等。同时百里香酚也可用来处理伤口,贮存解剖标本。此外，百里香酚还可作为抗氧剂、检定氮化钛用的特殊试剂，百里酚蓝指示剂的对比基准以及合成许多化学品的初级原料。百里香属包含300～400种芳香草本植物，其中大部分百里香属常用来治疗干咳、支气管炎、喉炎、消化不良。研究表明百里香属的生物活性作用主要来源于其酚羟基的结构，尤其是百里香和香芹酚这两种。百里香中的精油含量比香芹酚中的精油含量高很多，这类化合物比苯酚的抗菌活性高30倍，并且毒性比苯酚小4倍。
[0003]近年来百里香酚和香芹酚多用于制作香料，防腐剂，医疗用品和驱虫剂，研究表明百里香酚具有杀螨抑菌等多种生物活性，百里香酚对刺足根螨的杀毒作用，发现百里香酚对芽孢杆菌的生长具有明显的抑制作用。近年来，百里香酚衍生物得到了国内外研究学者的广泛关注，合成的百里香酚衍生物也越来越多。
[0004]目前市面上百里香酚及其衍生物的主要合成方式是化学合成，在生物合成方面仍有较大的发展空间，利用微生物合成百里香酚及其衍生物能有效的减少企业生产成本。因此，创建一条效率较高的百里香酚和香芹酚制备方法迫在眉睫。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种合成植物精油关键组分的重组菌及其构建方法和应用，通过该重组菌能够生产获得较高产量的百里香酚和香芹酚。
[0007]本专利技术是这样实现的：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种合成植物精油关键组分的重组菌，该重组菌中含有外源基因；该外源基因包括萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因；
[0009]上述植物精油关键组分包括百里香酚和香芹酚。
[0010]第二方面，本专利技术提供了上述合成植物精油关键组分的重组菌的构建方法，其包括以下步骤：将经过密码子优化后的萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌中，即获得重组菌。
[0011]第三方面，本专利技术提供了上述重组菌应用，该应用包括利用上述重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚。
[0012]本专利技术具有以下有益效果：
[0013]本专利技术通过导入萜类合成酶，细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因，成功地构建出一种可以合成百里香酚和香芹酚的重组菌，实现了百里香酚衍生物的异源合成。而且利用本专利技术的重组菌转化生产百里香酚和香芹酚，生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
[0014]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0015]图1为本专利技术中百里香酚和香芹酚的合成途径；
[0016]图2为本专利技术中重组质粒构建示意图，其中图2
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A为TvTPS2
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PrTEFin
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TvSDR1
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T
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pcfb4586，图2
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B为TvTPS2
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PrTEFin
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TvCYP71D507
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T
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pcfb5791；
[0017]图3为实验例1的重组酵母干重数据对比；
[0018]图4为实验例2的重组酵母不同发酵时间产物分析；
[0019]图5为实验例2的发酵后重组酵母的产物含量对比；
[0020]图6为实验例3中不同的细胞色素p450基因构建的重组菌的产物含量对比。
具体实施方式
[0021]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0022]本专利技术提供了一种合成植物精油关键组分的重组菌，该重组菌中含有外源基因；该外源基因包括萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因；上述植物精油关键组分包括百里香酚和香芹酚。
[0023]在本专利技术中，专利技术人首次将百里香中的萜类合成酶，细胞色素P450以及短链脱氢酶基因导入出发菌中，使香叶基二磷酸在萜烯合成酶(TvTPS2)的作用下环化为γ
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松油烯。细胞色素P450(TvCYP71D507
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T)使γ
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松油烯在C
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3或C
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6上羟基化，二烯醇中间体被短链脱氢酶(SDR)转化为相应的酮，合成途径如图1所示。
[0024]根据上述反应原理，专利技术人将编码萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因导入出发菌中，获得一种重组菌，再通过该重组菌发酵生产百里香酚和香芹酚。
[0025]在一些实施方式中，萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因来源于百里香。
[0026]在一些实施方式中，重组菌的出发菌为酵母菌；较为优选地，该酵母菌为解脂耶氏酵母，具体地，该解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母pO1f菌株。
[0027]在本专利技术中，出发菌选择解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是由于其相比其他酵母具有更加高效的戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway)和乙酰
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CoA代谢能
力，能为细胞提供大量NADPH和底物用于合成脂肪酸，解脂耶氏酵母细胞含油量高，能达到干重的30％以上。并且，解脂耶氏酵母是能够工业生产的安全菌株，得到了美国FDA的GRAS认证，有成熟的发酵生产技术，是生产萜类物质的理想底盘生物。
[0028]为了获得上述重组菌，本专利技术还提供了该重组菌的构建方法，其包括将经过密码子优化后的萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌中，即获得重组菌。
[0029]在一些实施方式中，萜类合成酶包括TvTPS2，密码子优化后的TvTPS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0030]在一些实施方式中，细胞色素P450包括TvCYP71D507
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T，密码子优化后的TvCYP71本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成植物精油关键组分的重组菌，其特征在于，所述重组菌中含有外源基因；所述外源基因包括萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因；所述植物精油关键组分包括百里香酚和香芹酚。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因来源于百里香。3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的出发菌为酵母菌；优选地，所述酵母菌包括解脂耶氏酵母pO1f。4.如权利要求1
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3任一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将经过密码子优化后的萜类合成酶、细胞色素P450以及短链脱氢酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌中，即获得所述重组菌。5.根据权利要求4所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述萜类合成酶包括TvTPS2，密码子优化后的TvTPS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。6.根据权利要求5所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述细胞色素P450包括TvCYP71D507
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T，密码子优化后的TvCYP71D507
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T的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。7.根据权利要求6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚阳敏，张毅，郑明明，万霞，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：