一种用于冠状病毒核酸双位点同时检测的试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于冠状病毒核酸双位点同时检测的试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒包括双位点检测探针和催化探针C1、C2；所述双位点检测探针包括纳米颗粒载体、由DNA锚定链AP、DNA连接链L1和DNA荧光报告链R1组成的位点一识别单元、由DNA连接链L2和DNA输出链R2组成的位点二识别单元；两个位点识别单元之间通过L1和L2部分序列互补形成复合杂交体；复合杂交体由AP与纳米颗粒载体连接形成双位点检测探针；L1和L2的序列分别与两段待测冠状病毒核酸特征序列T1、T2互补；C1、C2为分别针对T1、T2的催化元件。本发明专利技术的试剂盒仅需荧光激发灯即可快速便捷的检测病毒，适用于核酸的快速现场诊断。场诊断。场诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种用于冠状病毒核酸双位点同时检测的试剂盒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于荧光生物传感及核酸检测
，具体涉及一种用于冠状病毒核酸双位点同时检测的试剂盒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]冠状病毒是具囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，在自然界中广泛存在，可引起人类呼吸系统感染。冠状病毒的快速检测和早期筛查对于及时防止疫情扩散至关重要，亟需发展快速检测和筛查病毒的新试剂和新方法。RT
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PCR(逆转录聚合酶链反应)是检测冠状病毒核酸常见方法，可实现对目标基因的扩增和检测，但是传统的RT
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PCR技术需要在反应终点时，通过凝胶电泳来判断目标基因是否存在，且其检测灵敏度比较低，定量也不够准确。通过PCR技术与荧光标记相结合，使用荧光标记的引物为探针来产生荧光信号，可极大地提高病毒核酸的检测限。但是，RT
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PCR技术极度依赖专业仪器与操作人员，存在耗时长、成本高及操作繁琐的问题，无法满足实际病毒检测场景的需要。由于缺少专业设备和专业人员，资源匮乏地区的即时现场检测是亟需解决的问题，因此，开发操作便捷、耗时较短的即时检测技术迫在眉睫。
[0003]相比于需要精确复杂控温程序和专业设备的RT
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PCR技术，无酶核酸等温扩增技术不需要精准控温的仪器，可在温和条件下实现对目标核酸序列的扩增，能够提高检测灵敏度和检测限，在现有的多种核酸检测方案中极具优势。基于核酸链置换反应的无酶等温核酸扩增技术以其高度的特异性和灵敏度近年来吸引了研究者的广泛关注，包括链置换扩增(Strand Displacement Amplification，SDA)、杂交链式反应(Hybridization Chain Reaction，HCR)、催化发夹自组装(Catalytic Hairpin Assembly，CHA)等，其特定的核酸序列易于合成和精确修饰，且不同方案之间由于其高度的可编程性可以进行组合，具有高度的灵活性和稳定性，该方法在生物传感领域具有潜在应用价值。磁颗粒(Magnetic Beads，MB)以其优异的高比表面积、良好的分子富集特性及快速分离特性在即时传感器的构建中独具优势。
[0004]综上，当前检测冠状病毒的方案存在特异性差、耗时长、受大型仪器限制、操作复杂、成本较高等缺点。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种用于冠状病毒核酸双位点同时检测的试剂盒及其制备方法和应用，可用于多种冠状病毒的核酸检测，实现对冠状病毒的特异性、即时、便捷、低成本的检测。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种用于冠状病毒核酸双位点同时检测的试剂盒，包括双位点检测探针和催化探针C1、C2；所述双位点检测探针包括纳米颗粒载体、位点一识别单元、位点二识别单元；
[0008]所述位点一识别单元由DNA锚定链AP、DNA连接链L1和DNA荧光报告链R1组成；
[0009]所述位点二识别单元由DNA连接链L2和DNA报告链R2组成；
[0010]所述位点一识别单元和位点二识别单元之间通过L1和L2部分序列互补形成复合杂交体；所述复合杂交体由DNA锚定链AP与纳米颗粒载体连接形成所述双位点检测探针；
[0011]所述L1和L2的序列分别与两段待测病毒核酸特征序列T1、T2互补；
[0012]所述AP的一端连有生物素或氨基，能使DNA锚定链连接到纳米颗粒载体上，AP的序列与L1的序列部分互补；所述AP具有如SEQ ID No.1所示的序列；
[0013]所述L1上杂交有修饰荧光的R1并与所述位点二识别单元通过L2杂交，并且L1的序列与一段待测病毒核酸特征序列T1部分互补；
[0014]所述L2与R2的序列部分互补，并且L2的序列与另一段待测病毒核酸特征序列T2部分互补；
[0015]所述C1与L1的序列部分互补；所述C2与L2的序列部分互补；
[0016]所述C1和C2可以在T1、T2同时存在时打开AP/L1/L2/R1/R2的复合杂交体，进行无酶核酸等温扩增反应，释放出荧光链R1，指示体系中待测病毒核酸特征序列T1、T2的同时存在；在此过程中释放出T1、T2进行循环利用，实现信号扩增。
[0017]优选地，所述纳米颗粒载体为可以通过物理或化学方式与DNA锚定链AP结合并且通过磁分离或离心的相分离方式实现液相分离的材料，所述纳米颗粒载体包括但不限于磁颗粒、金纳米颗粒、银纳米颗粒；所述R1所修饰的荧光为近红外二区荧光分子、上转换粒子、量子点、罗丹明、花菁染料、金纳米簇、含芳香烃/杂环结构的荧光团中的一种。
[0018]优选地，还包括预扩增试剂盒、待测病毒核酸阳性检测样本和Tris缓冲液；所述待测病毒核酸阳性检测样本包括特征序列T1、T2。
[0019]优选地，所述待测病毒为SARS
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CoV
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2；
[0020]所述T1为SARS
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CoV
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2 N2基因片段，具有如SEQ ID No.2所示的序列；
[0021]所述T2为SARS
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CoV
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2 ORF1ab基因片段，具有如SEQ ID No.3所示的序列；
[0022]所述C1为针对SARS
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CoV
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2 N2基因片段的催化元件DNA，具有如SEQ ID No.4所示的序列；
[0023]所述C2为针对SARS
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CoV
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2 ORF1ab基因片段的催化元件DNA，具有如SEQ ID No.5所示的序列；
[0024]所述L1具有如SEQ ID No.6所示的序列；
[0025]所述L2具有如SEQ ID No.7所示的序列；
[0026]所述R1具有如SEQ ID No.8所示的序列；
[0027]所述R2具有如SEQ ID No.9所示的序列。
[0028]优选地，所述待测病毒为SARS
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CoV；
[0029]所述T1为SARS
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CoV N2基因片段，具有如SEQ ID No.10所示的序列；
[0030]所述T2为SARS
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CoV ORF1ab基因片段，具有如SEQ ID No.11所示的序列；
[0031]所述C1为针对SARS
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CoV N2基因片段的催化元件DNA，具有如SEQ ID No.12所示的序列；
[0032]所述C2为针对SARS
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CoV ORF1ab基因片段的催化元件DNA，具有如SEQ ID No.13所示的序列；
[0033]所述L1具有如SEQ ID No.14所示的序列；
[0034]所述L2具有如SEQ ID No.15所示的序列；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于冠状病毒核酸双位点同时检测的试剂盒，其特征在于，包括双位点检测探针和催化探针C1、C2；所述双位点检测探针包括纳米颗粒载体、位点一识别单元、位点二识别单元；所述位点一识别单元由DNA锚定链AP、DNA连接链L1和DNA荧光报告链R1组成；所述位点二识别单元由DNA连接链L2和DNA报告链R2组成；所述位点一识别单元和位点二识别单元之间通过L1和L2部分序列互补形成复合杂交体；所述复合杂交体由DNA锚定链AP与纳米颗粒载体连接形成所述双位点检测探针；所述L1和L2的序列分别与两段待测病毒核酸特征序列T1、T2互补；所述AP的一端连有生物素或氨基，能使DNA锚定链连接到纳米颗粒载体上，AP的序列与L1的序列部分互补；所述AP具有如SEQ ID No.1所示的序列；所述L1上杂交有修饰荧光的R1并与所述位点二识别单元通过L2杂交，并且L1的序列与一段待测病毒核酸特征序列T1部分互补；所述L2与R2的序列部分互补，并且L2的序列与另一段待测病毒核酸特征序列T2部分互补；所述C1与L1的序列部分互补；所述C2与L2的序列部分互补；所述C1和C2可以在T1、T2同时存在时打开AP/L1/L2/R1/R2的复合杂交体，进行无酶核酸等温扩增反应，释放出荧光链R1，指示体系中待测病毒核酸特征序列T1、T2的同时存在；在此过程中释放出T1、T2进行循环利用，实现信号扩增。2.根据权利要求1所述的一种用于冠状病毒核酸双位点同时检测的试剂盒，其特征在于，所述纳米颗粒载体为可以通过物理或化学方式与DNA锚定链AP结合并且通过磁分离或离心的相分离方式实现液相分离的材料，所述纳米颗粒载体包括但不限于磁颗粒、金纳米颗粒、银纳米颗粒；所述R1所修饰的荧光为近红外二区荧光分子、上转换粒子、量子点、罗丹明、花菁染料、金纳米簇、含芳香烃/杂环结构的荧光团中的一种。3.根据权利要求1所述的一种用于冠状病毒核酸双位点同时检测的试剂盒，其特征在于，还包括预扩增试剂盒、待测病毒核酸阳性检测样本和Tris缓冲液；所述待测病毒核酸阳性检测样本包括特征序列T1、T2。4.根据权利要求1所述的一种用于冠状病毒核酸双位点同时检测的试剂盒，其特征在于，所述待测病毒为SARS
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CoV
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2；所述T1为SARS
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CoV
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2N2基因片段，具有如SEQ ID No.2所示的序列；所述T2为SARS
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CoV
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2ORF1ab基因片段，具有如SEQ ID No.3所示的序列；所述C1为针对SARS
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CoV
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2N2基因片段的催化元件DNA，具有如SEQ ID No.4所示的序列；所述C2为针对SARS
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CoV
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2ORF1ab基因片段的催化元件DNA，具有如SEQ ID No.5所示的序列；所述L1具有如SEQ ID No.6所示的序列；所述L2具有如SEQ ID No.7所示的序列；所述R1具有如SEQ ID No.8所示的序列；所述R2具有如SEQ ID No.9所示的序列。5.根据权利要求1所述的一种用于冠状病毒核酸双位点同时检测的试剂盒，其特征在
于，所述待测病毒为SARS
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CoV；所述T1为SARS...

【专利技术属性】
技术研发人员：王子纯，朱丹，汪联辉，晁洁，张若轩，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：