一株猪细小病毒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)及其应用。本发明专利技术的猪细小病毒，从病猪组织中分离，名称为PPV

【技术实现步骤摘要】
一株猪细小病毒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一株分离纯化的猪细小病毒及其应用。

技术介绍

[0002]猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)，属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(parvovirus)，单股DNA，无囊膜，基因组约5.2Kb。成熟PPV完整病毒粒子外观呈六角形或圆形、典型的二十面立体对称结构，血清型单一，很少发生变异。病毒对热及酸碱均具有较强抵抗力。PPV基因组编码了3种结构蛋白：VP1、VP2、和VP3，分子量分别是84kDa、64kDa和60kDa，是PPV的主要免疫原性抗原。
[0003]1967年分离到猪细小病毒并首次证明了它的致病作用。PPV最早出现在欧洲，我国于1982年分离到该病毒。PPV感染能引起猪的繁殖障碍性疾病。PPV感染母猪后产死胎、畸形胎、木乃伊胎、流产及病弱仔猪，猪群暴发该病时常与木乃伊胎、窝仔数减少等临床表现有关。带毒猪和病猪是本病的传染源，经消化道、呼吸道、精液进行传播，各种不同年龄、性别的家猪和野猪均易感。目前研究结果表明：PPV对猪的影响主要分为两个方面：一是对母猪受精卵细胞的影响，二是对胎儿发育的影响。采集流产或死产胎儿的新鲜组织病毒分离鉴定。随着生猪养殖业集约化程度不断提高，该病对生猪养殖业的危害日趋严重。
[0004]目前PPV在我国呈流行趋势。随着各种猪病毒病的不断发生，外界环境的复杂和猪群体抗力的下降，近年来，PPV感染呈扩大上升的趋势、越来越多的猪场相继爆发PPV，给养殖业造成了一定的危害和巨大的经济损失，及时研发高效的疫苗和诊断试剂盒，对于防控该病具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一株猪细小病毒及其部分基因组序列，以及基于分离株制备的灭活疫苗在猪细小病毒病防控中的应用。
[0006]为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]第一方面，本专利技术提供一株猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)及其VP2基因组核苷酸序列，该序列具有特殊变异位点。
[0008]本专利技术将某猪场的病猪组织研磨液接种ST细胞，经细胞传代、纯化及鉴定，得到一株猪细小病毒，命名为PPV
‑
ZM2021，于2022年9月15日中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.45271。本专利技术提供猪细小病毒分离株的VP2基因组序列，如SEQ ID N o.1所示。
[0009]上述猪细小病毒PPV
‑
ZM2021经悬浮培养能到达高滴度，其在细胞上增殖稳定，滴度高达10
9.0
TCID
50
/0.1mL。
[0010]采用该猪细小病毒分离株PPV
‑
ZM2021制备的疫苗能够诱导猪产生高水平的中和抗体、交叉保护性好。
[0011]第二方面，本专利技术提供一种含有所述猪细小病毒毒株的生物制品，所述生物制品用于预防、或诊断猪细小病毒病。
[0012]所述的生物制品可以是疫苗或诊断试剂。
[0013]其中，所述的疫苗为活疫苗或灭活苗。
[0014]本专利技术提供的包含所分离猪细小病毒的灭活疫苗。所述灭活疫苗由猪细小病毒PPV
‑
ZM2021接种ST细胞进行传代培养、收获病毒液、测定毒价，灭活，然后按重量比1:1比例与佐剂混匀。
[0015]佐剂可以为任何动物疫苗可用的佐剂，其中佐剂可以由如下重量百分含量的组分制成：注射用水溶液90％，聚乙烯吡咯烷酮2％，聚乳酸
‑
羟乙酸(PLGA)3％，聚乙二醇6000 1％，烷基糖苷(癸基葡糖苷)(APG0816)2％，聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯1％，鲸蜡醇1％。
[0016]所述灭活疫苗抗原含量为每头份不低于10
8.0
TCID
50
/0.1mL，免疫途径为肌肉注射或鼻腔接种，优选地，肌肉注射途径。
[0017]所述诊断试剂可以为ELISA试剂盒，其中，包括所述猪细小病毒毒株全病毒包被的酶标板和酶标二抗。
[0018]在此基础上，含有本专利技术所述猪细小病毒在制备用于防控、诊断猪细小病毒病的其他生物制品也属于本专利技术的保护范围。
[0019]本专利技术的有益效果在于：
[0020]本专利技术的专利技术人于2021年从某猪场病猪组织中分离并经传代纯化，获得一株猪细小病毒，命名为PPV
‑
ZM2021。该分离株在传代细胞上增殖性好，对仔猪无明显致病力，且免疫原性优异，能够诱导仔猪产生高水平中和抗体，为猪细小病毒的有效防控奠定坚实的基础。
[0021]利用本专利技术所得猪细小病毒PPV
‑
ZM2021在易感细胞系ST上增殖快，增殖滴度高，可达10
9.0
TCID
50
/0.1mL；本专利技术猪细PPV
‑
ZM2021小病毒株致病力低，用10
9.0
TCID
50
/0.1mL病毒液对断奶仔猪进行鼻腔攻毒，连续观察10天，攻毒断奶仔猪无体温升高和腹泻等临床症状，全部存活。以本专利技术毒株制备的灭活疫苗，免疫原性好，能够诱导仔猪产生高水平的中和抗体，为猪细小病毒病的有效防控提供了重要生物材料。
[0022]建立血清抗体检测方法对于筛选细小病毒阴性猪有重要的作用。ELISA具有敏感性高、特异性好、可批量操作的特点，便于临床推广应用。本专利技术提供的包含所分离猪细小病毒的ELISA试剂盒，能较好的检测血清中的猪细小病毒抗体，为该病的有效检测提供了重要基础。
附图说明
[0023]图1为猪细小病毒分离株在ST贴壁细胞上培养，其中，A为猪细小病毒在ST细胞上的病变(CPE)，B为正常ST细胞对照。
[0024]图2为猪细小病毒的氨基酸变异图。
具体实施方式
[0025]下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0026]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例
中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂均为市售产品。
[0027]实施例1猪细小病毒的分离
[0028]1.病猪组织的采集与处理
[0029]采集病猪组织，剪碎，加入10倍体积含500单位双抗的DMEM培养基研磨，4℃，12000rpm离心5min，取研磨液上清，
‑
80℃冻存备用。
[0030]2.病猪组织病原检测
[0031]取200μl上述研磨液上清，用北京全式金生物公司DNA/RNA提取试剂盒，按说明书步骤提取DNA和RNA；然后，用全式金反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以提取的DNA和反转录cDNA为模板，分别用猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)毒株，其特征在于：所述猪细小病毒毒株的名称为PPV
‑
ZM2021，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.45271。2.根据权利要求1所述的猪细小病毒毒株，其特征在于：所述猪细小病毒的VP2基因组核苷酸序列如序列表中序列1所示。3.含有权利要求1或2所述猪细小病毒毒株的生物制品，所述生物制品用于预防或诊断猪细小病毒病。4.根据权利要求3所述的生物制品，其特征在于：所述的生物制品为疫苗或诊断试剂。5.根据权利要求4所述的生物制品，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨小蓉，马良，刘孟兮，常昊天，王天恺，潘京学，黄书林，张君，谢云浩，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：