基于EAT1基因构建水稻显性核不育材料的方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种基于EAT1基因构建的水稻显性核不育表达载体及其应用。所述表达载体有Ubiquitin启动子和水稻雄花发育基因EAT1可操作的连接而形成。具体构建方法包括：获取水稻cDNA，并以其为模板，采用EAT1基因的特异引物扩增EAT1基因，得到PCR产物片段；将PCR产物片段连入带有Ubiquitin启动子的骨架载体中即得。利用该表达载体获得的转基因植株表现为显性核雄性不育，并可通过杂交创制水稻显性核雄性不育系。利用该显性核不育系进行轮回选择育种，可快速淘汰非目标材料，高效聚合多种优异性状和基因，且不含有转基因成分，有效提高育种效率和安全性。种效率和安全性。种效率和安全性。

【技术实现步骤摘要】
基于EAT1基因构建水稻显性核不育材料的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及育种和植物基因工程
，具体涉及一种基于EAT1基因构建水稻显性核不育材料的方法及其应用。

技术介绍

[0002]水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的粮食作物之一，全世界有半数以上的人口（在我国超过 60%）以水稻为主食。随着全球气候变化、人口不断增加以及耕地不断减少，世界性的粮食危机日益严峻，因此，提高以水稻为代表的粮食作物的产量显得极为重要。
[0003]实践证明，充分利用现代分子生物学研究手段，不断挖掘新的水稻雄性不育基因资源、创制各类雄性不育系，是提高水稻产量的有效手段。然而，绝大部分水稻雄性不育系是隐性核不育，需要与之配套的保持系和繁殖技术体系，在实际生产中还存在诸多困难。与之相比，显性核不育材料的不育性受显性基因控制，用可育材料与它杂交，后代的可育株与不育株各占一半，这对于杂交制种有非常重要的意义。利用显性核不育系，可以进行大规模的轮回选择育种，以高效聚合多种优异性状和基因（如高产、抗病和抗逆等）。因此，针对显性核不育材料的相关研究一直是个热点。
[0004]近年来，超过40个水稻雄性育性相关基因被克隆，如OsMS1、GAMYB、UDT1、TDR和EAT1等。这些基因很多编码转录因子，通过调节下游相关基因的表达，影响花粉和绒毡层的发育。其中，EAT1基因编码bHLH类转录因子，通过激活两个编码天冬氨酸蛋白酶的基因OsAP25和OsAP37的表达，启动花药绒毡层细胞程序性死亡（参考文献：Niu N, Liang W, Yang X, et al. EAT1 promotes tapetal cell death by regulating aspartic proteases during male reproductive development in rice[J]. Nature Communications, 2013, 4: 1445）。通过基因敲除创制的EAT1功能缺失突变体表现为隐性核雄性不育，其杂合体后代呈简单的孟德尔式分离，并不能使不育性保持，因此在生产应用上受到了很大的限制。另一方面，已有研究通过创制过表达载体，发现bHLH类转录因子TIP2、TDR等过量表达会导致水稻植株出现雄性不育表型，且该性状可能为显性遗传（参考文献：Ko S S, Li M J, Ho Y C, et al. Rice transcription factor GAMYB modulates bHLH142 and is homeostatically regulated by TDR during anther tapetal and pollen development[J]. Journal of Experimental Botany, 2021, 72(13): 4888
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4903）。但目前尚未有这些基因在育种上应用的报道，也没有针对EAT1基因构建过表达材料的研究。本专利技术旨在基于EAT1基因的过表达，为创制显性核不育材料提供新的方法。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题和缺陷，本专利技术提供一种基于EAT1基因构建水稻显性核不育材料的方法及其应用。利用该方法可创制水稻显性核雄性不育系，以及利用该显性核不育系进行轮回选择育种，可快速淘汰非目标材料，高效聚合多种优异性状和基因，有效提高育种效率。本专利技术的技术方案为：
第一方面，本专利技术提供一种基于EAT1基因构建的水稻显性核不育表达载体，所述表达载体由Ubiquitin启动子和水稻雄花发育基因EAT1可操作的连接而形成。
[0006]水稻雄花发育基因EAT1具有启动绒毡层细胞程序性死亡的功能，其序列如SEQ ID NO.2所示。目前仅发现EAT1的功能丧失会影响水稻花粉发育，证实水稻维持正常育性需要EAT1的参与。而本专利技术还进一步证实EAT1基因的过量表达也会导致水稻雄性不育。经过一系列分析发现，EAT1的过量表达会导致花药绒毡层提前降解，这一发现在之前从未被报道。
[0007]Ubiquitin启动子来自玉米，可控制基因呈组成型表达，其序列如SEQ ID NO.1所示。第二方面，本专利技术提供上述表达载体的构建方法，包括：获取水稻cDNA，并以其为模板，采用EAT1基因的特异引物扩增EAT1基因，得到PCR产物片段；将PCR产物片段连入带有Ubiquitin启动子的骨架载体中，即得。
[0008]进一步地，所述特异引物包括上游引物EAT1
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OE
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F和下游引物EAT1
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OE
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R，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0009]第三方面，本专利技术提供上述表达载体在调控水稻植株育性上的应用。
[0010]第四方面，本专利技术提供一种水稻显性核雄性不育植株的构建方法，是采用上述表达载体，构建方法包括：步骤1，将所述表达载体转化到农杆菌中并培养；步骤2，将获得的含有表达载体的农杆菌浸染水稻愈伤组织，然后进行脱分化和再分化处理；步骤3，炼苗并移栽培养，即得。
[0011]第五方面，本专利技术提供一种水稻显性核雄性不育系的构建方法，是以上述构建方法获得的水稻显性核雄性不育植株为母本，以可育水稻作为父本，通过杂交方法获得。
[0012]第六方面，本专利技术提供上述水稻显性核雄性不育系的鉴定方法，是将上述构建方法获得的水稻显性核雄性不育系植物的叶片提取RNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，利用EAT1基因的鉴定引物对EAT1基因进行qPCR反应，再与野生型中EAT1的表达进行比较，其中EAT1的表达量显著高于野生型的即为水稻显性核雄性不育系，所述显著高于的标准为：P<0.05，T检验。
[0013]进一步地，所述叶片取自水稻显性核雄性不育系种子从苗期到成熟期生长阶段的任一时期。
[0014]进一步地，所述鉴定引物包括上游引物EAT1
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RT
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F1和下游引物EAT1
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RT
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R1，序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0015]进一步地，所述鉴定方法以OsActin1基因为内参基因，内参引物包括上游引物Actin1
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RT
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F1和下游引物Actin1
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RT
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R1，序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
[0016]第七方面，本专利技术提供利用水稻显性核雄性不育植株进行轮回选择育种的方法，包括：（1）以上述水稻显性核雄性不育植株为母本，具有优良性状和基因的水稻为父本，进行杂交，收获F1种子；（2）将F1种子种植并人工隔离，抽穗期分离出不育株和可育株；以不育株作为母本，授以可育株的花粉，收获不育株上的种子，作为第1轮轮回选择群体种子；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于EAT1基因构建的水稻显性核不育表达载体，其特征在于：所述表达载体由Ubiquitin启动子和水稻雄花发育基因EAT1可操作的连接而形成。2.权利要求1所述的表达载体的构建方法，其特征在于：包括：获取水稻cDNA，并以其为模板，采用EAT1基因的特异引物扩增EAT1基因，得到PCR产物片段；将PCR产物片段连入带有Ubiquitin启动子的骨架载体中，即得。3.根据权利要求2所述的表达载体的构建方法，其特征在于：所述特异引物包括上游引物EAT1
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OE
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F和下游引物EAT1
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OE
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R，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。4.权利要求1所述的表达载体或者权利要求2或3所述的构建方法获得的表达载体在调控水稻植株育性上的应用。5.一种水稻显性核雄性不育植株的构建方法，其特征在于：是采用权利要求1所述的表达载体或者权利要求2或3所述的构建方法获得的表达载体，构建方法包括：步骤1，将所述表达载体转化到农杆菌中并培养；步骤2，将获得的含有表达载体的农杆菌浸染水稻愈伤组织，然后进行脱分化和再分化处理；步骤3，炼苗并移栽培养，即得。6.一种水稻显性核雄性不育系的构建方法，其特征在于：是以权利要求5所述的构建方法获得的水稻显性核雄性不育植株为母本，以可育水稻作为父本，通过杂交方法获得。7.权利要求6所述的构建方法获得的水稻显性核雄性不育系的鉴定方法，其特征在于：是将获得的水稻显性核雄性不育系种子叶片提取RNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，利用EAT1基因的鉴定引物对EAT1基因进行qPCR反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：李双成，邹挺，陶阳，陈豪，李平，邓其明，王世全，梁越洋，朱军，刘怀年，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：