一种玫瑰耐盐基因RrGTγ-4及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种野生玫瑰耐盐基因RrGTγ

【技术实现步骤摘要】
一种玫瑰耐盐基因RrGT
γ
‑
4及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4及其应用。

技术介绍

[0002]蔷薇科蔷薇属落叶灌木野生玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）是国家二级濒危保护植物，自然分布于中国东北沿海地区、俄罗斯远东地区、朝鲜半岛和日本。其适应高盐度生境，具有很强的耐盐性以，是蔷薇属植物耐盐品种培育珍贵的亲本材料。栽培玫瑰的观赏、品质性状优良，富含玫瑰精油等芳香物质，广泛用于香料工业，长期的人工选择导致栽培品种耐盐性较弱，而我国玫瑰主产区存在丰富的盐渍土资源，无法被充分利用，限制了玫瑰产业的推广和发展。
[0003]Trihelix转录因子家族被发现是由于该成员的保守结构域可以与光响应所需的GT元件特异性地结合，从而行使它的正调控或负调控功能。这类蛋白对生物和非生物胁迫做出反应，并参与花、气孔、种子等发育过程[1, 2]。近年来的研究中，根据三螺旋转录因子不同的结构域，三螺旋TFs主要被分为五个亚家族，分别为SIP1、GT
‑
1、GT
‑
2、GTγ和SH4。Trihelix转录因子家族中GT因子的DNA结合域含有三个保守的串联螺旋结构，GT
‑
2亚家族含有两个Trihelix保守结构域（DNA结合结构域），SH4亚家族没有第四α螺旋结构域，携带一个延伸的第三个三螺旋，其他亚家族包含一个保守结构域，一个第四α螺旋结构域和一个各不相同的α螺旋结构域。
[0004]在过去的研究报道中Trihelix转录因子在植物生长发育过程承担着重要作用，近年来有关其响应非生物胁迫的研究日益增多。迄今为止，除了SH4外每个亚家族都有成员参与非生物胁迫响应的报道，其中，GT
‑
1和SIP1亚家族的研究主要集中于ABA敏感性变化，GTγ亚家族专注于耐盐胁迫，对于GT
‑
2亚家族的研究较为综合全面，包含干旱、冷、盐胁迫等。另外，现有的模式种如：拟南芥、水稻、大豆等[4
‑
6]都已有Trihelix的全基因组分析，芜菁、苦荞麦、毛竹等物种[7
‑
13]的相关研究也相继发表，小麦物种[14, 15]还有正常环境和非生物胁迫，不同情况下的全基因组分析研究。
[0005]玫瑰Trihelix基因家族及其成员对耐盐性的调控尚未开展研究，探究玫瑰耐盐调控的Trihelix成员，对蔷薇属植物抗性育种具有指导意义，为培育高耐盐性同时兼具经济价值的优良玫瑰新品种的提供基础，促进玫瑰产业发展。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4及其应用，第一个目的是提供玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4，另一目的是玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4的应用。
[0007]本专利技术的目的是这样实现的：一种玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]含有所述的玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4的过表达载体。即，含有所述玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4植物过表达载体pNC
‑
Cam1304
‑
MCS35S：RrGTγ
‑
4。所述载体组装有NC克隆框（Nimble Cloning Frame），可以一步法快速组装基因片段，获得35S启动子
‑
RrGTγ
‑4‑
NOS终止子的超表达框，可以保证RrGTγ
‑
4基因稳定持续在宿主细胞内大量表达。
[0009]所述玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4在提高玫瑰耐盐性中的应用。
[0010]通过本专利技术，本专利技术公开了一种野生玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4及其应用，RrGTγ
‑
4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术通过将野生玫瑰的RrGTγ
‑
4基因分离后，转入模式植物拟南芥，转基因拟南芥的耐盐性显著增强，表明RrGTγ
‑
4基因是耐盐性的正调控因子，在培育栽培玫瑰耐盐抗逆育种领域有重要应用价值。
[0011]有益效果：本专利技术以野生玫瑰为材料，克隆了RrGTγ
‑
4基因，检测了RrGTγ
‑
4基因在盐处理下的表达模式，通过遗传转化提高了过表达拟南芥的耐盐性，证明其为耐盐性正调控因子，对培育耐盐玫瑰新种质有重要应用价值。
附图说明
[0012]图1是RrGTγ
‑
4基因时空表达模式图；图2是植物过表达载体pNC
‑
Cam1304
‑
MCS35S质粒图谱；图3是RrGTγ
‑
4过表达拟南芥耐盐表型；图4是RrGTγ
‑
4过表达拟南芥表型统计图。
具体实施方式
[0013]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。
[0014]实施例11、RrGTγ
‑
4基因克隆以为野生玫瑰叶片的cDNA为模板，扩增基因编码区片段，连接克隆载体并测序，得到基因核苷酸序列。
[0015]I.引物设计基于玫瑰转录本，设计RrGTγ
‑
4基因的包含完整开放阅读框的上下游引物Primer F：5
’‑ꢀ
TGCAGAGATTAGACTATGACA
ꢀ‑3’
Primer R：5
’‑ꢀ
ATACATATTATCCGGTGAGGT
ꢀ‑3’
II. 基因分离通过FastPure Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒（Vazyme）提取野生玫瑰叶片和根系总RNA，具体步骤如下：1）在待用的超净工作台中喷施RNase和核酸清除剂，排除RNase对后续实验的干扰。
[0016]2）将Buffer PRL在水浴锅中预热至65 ℃，并在其中加入5 %的β
‑
巯基乙醇。
[0017]3）取约0.3 g样品于研钵中，加入液氮迅速冷冻研磨，加入65 ℃预热的500 μl Buffer PRL立即剧烈涡旋振荡60 sec，使其充分裂解。
[0018]4）将裂解混合物在65 ℃水浴锅中水浴5 min，期间颠倒1
‑
2次帮助裂解，随后
12000 rpm离心10 min。
[0019]5）吸取上清液至新的1.5 ml RNase
‑
free离心管中，并加入0.5倍上清体积的Ethanol本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4，其特征在于，玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4，其特征在于，玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.含有权利要求1所述玫瑰耐盐基因RrGTγ
‑
4植物过表达载体pNC
‑
Cam1304
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建文，冯立国，程雨飞，施鑫玮，王悦，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：