一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒及方法。所述试剂盒包括正义引物、反义引物和耐高温限制性内切酶，所述正义引物和反义引物为分别结合PIK3CA基因E542K突变(G>A)的上游和下游的引物，所述耐高温限制性内切酶切割引入突变位点的PIK3CA基因E542K突变野生型片段。本发明专利技术巧妙结合PCR扩增和限制酶切，开发富集PIK3CA基因突变区片段的方法，可实现快速富集，且产物可直接进行后续检测，能够提高低丰度突变的检测灵敏性，操作简便，成本低，无需增加额外设备，利用广泛推广应用。利用广泛推广应用。利用广泛推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]PIK3CA基因最早发现于上世纪八十年代初，从人膀胱癌细胞系中初次分离出的一种转化基因，属于KRAS基因家族，可使NIH3T3细胞发生恶性转化，而从正常人组织中提取的DNA则无此种作用。PIK3CA基因就像体内一个“开关”，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用，正常的PIK3CA基因可抑制肿瘤细胞生长，而一旦发生突变，它就会持续刺激细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤的发生。
[0003]在不同的癌症当中存在不同的PIK3CA突变的比例：胰腺癌(90％)、结肠癌(50％)、肺癌(30％)、卵巢癌(15％)、甲状腺癌(50％)、膀胱癌(6％)，红斑性狼疮(SLE)、乳腺癌、肝癌、皮肤癌、类风湿性关节炎(RA)、肾癌及某些的白血病(Leukemia)都有较高的突变水平。及时检测PIK3CA突变具有重要意义，检测PIK3CA基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。
[0004]循环肿瘤DNA(ctDNA)突变检测是近年来兴起且发展迅速的肿瘤诊断技术，称为“液体活检”。ctDNA是由肿瘤细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统产生；随着基因测序的飞速发展，目前，已能在血液中对其进行检测并计数。ctDNA是一种特征性的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪，与组织活检相比ctDNA检查微创小、无放射性污染、经济、新DNA无防腐剂污染等优点，并允许对治疗反应实时监测。
[0005]由于ctDNA含量低(<1.0％总cfDNA)，片段短(180～200bp)，半衰期短(～2小时)，故其检测对痕量核酸检测技术提出全新的挑战。目前具备极微量核酸基因突变检测能力的技术主要有ARMS技术(包括Super
‑
ARMS)、第二代测序(NGS)和数字PCR(ddPCR，包括BEAMing技术)等。NGS技术可检测未知突变且检测基因数量不受限，在肿瘤耐药突变的监测与研究等领域有很大的应用潜力。然而，NGS建库技术复杂，常规建库测序方法使得血浆中含量极低的肿瘤信号完全淹没在背景噪声中，建库过程原始信息丢失严重或成为敏感度潜力发挥的限制因素。数字PCR技术，具有极高的敏感性，可绝对定量，但该方法检测通量较低。由于，ctDNA含量极少，且肿瘤DNA分子存在的数量远远不及正常细胞的DNA，肿瘤相关DNA被来自正常细胞DNA严重稀释，单分子丰度仅0.01％，化验结果极易被干扰，因此，能够特异性的富集样品中靶序列的富集技术是液体活检技术发展的关键。
[0006]综上所述，提供一种能够高效富集并检测血浆游离DNA中PIK3CA基因突变区的方法，对于PIK3CA基因检测领域具有重要意义。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒及方法，通过靶向富集样本中PIK3CA基因突变基因片段，提高该突变的检测灵敏度。
[0008]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括正义引物、反义引物和耐高温限制性内切酶，所述正义引物和反义引物为分别结合PIK3CA基因E542K突变的上游和下游的引物，所述耐高温限制性内切酶切割引入突变位点的PIK3CA基因E542K突变野生型片段。
[0010]本专利技术试剂盒中，针对PIK3CA基因E542K突变上下游的正义引物和反义引物能够对PIK3CA基因E542K突变进行PCR扩增，所述耐高温限制性内切酶能够切割PIK3CA基因5E542K突变野生型片段，可在反应过程中将野生型的DNA片段破坏，使得野生型的PCR产物越来越少，而突变型的DNA片段能在反应中不断的富集，从而能够提高低丰度突变的检测灵敏性。
[0011]本专利技术中，所述PIK3CA基因的E542K突变上下游区核酸序列如下：
[0012]AGTAACAGACTAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGAAAGATTTTCTATGGAGTCACAG，下划线标识突变位点，E542K(1624 G>A)
[0013]优选地，所述正义引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
[0014]优选地，所述反义引物的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
[0015]SEQ ID NO.1：5
’‑
CTACACGAGATCCTCTCACT
‑3’
。
[0016]SEQ ID NO.2：5
’‑
GCCAACTACCAATGTAGTA
‑3’
。
[0017]优选地，所述耐高温限制性内切酶可选自TspRⅠ内切酶。
[0018]本专利技术中，限制性内切酶TspRⅠ为耐高温内切酶，在PCR反应不会出现热失活，且其特异性识别序列为NNCASTGNN(N为A或T或C或G；S为C或G)，PIK3CA基因E542K突变为CTCTCTGAA与TspRI的特异性识别序列的第4位A碱基不相同，本专利技术在PCR引物中做出调整，将原始模板中的T碱基换为A碱基，即引入酶切位点：CTCACTGAA，当PIK3CA基因为野生型(CTCACTGAA)时，TspRI酶可将DNA双链切断；当E542K突变出现G>A突变(氨基酸E542K点突变)时，基因序列突变成CTCACTAAA，TspRI将不能识别该序列，不能将DNA双链切断。
[0019]本专利技术利用耐高温的限制性内切酶TspRⅠ，TspRⅠ内切酶能特异性识别PIK3CA基因E542K突变的野生型序列，并将其DNA双链切断；而当542位密码子出现G>A缺失突变时，基因序列突变成CTCACTAAA，TspRⅠ将不能识别该序列，不能将DNA双链切断,通过在普通的PCR反应中，加入耐高温的限制性内切酶，可在反应过程中将野生型的DNA片段破坏，使得野生型的PCR产物越来越少，而突变型的DNA片段能在反应中不断的富集，从而能够提高低丰度突变的检测灵敏性。
[0020]优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液。
[0021]优选地，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、dNTP、PCR反应缓冲液和水。
[0022]优选地，所述DNA聚合酶可选Taq DNA聚合酶。
[0023]第二方面，本专利技术提供一种富集PIK3CA基因突变区片段的方法，所述方法包括：
[0024]取待测样本DNA作为模板，利用第一方面所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒中正义引物和反义引物进行PCR扩增，在PCR扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括正义引物、反义引物和耐高温限制性内切酶；所述正义引物和反义引物为分别结合PIK3CA基因E542K突变的上游和下游的引物；所述耐高温限制性内切酶切割引入酶切位点的PIK3CA基因E542K突变野生型片段。2.根据权利要求1所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述正义引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；优选地，所述反义引物的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。3.根据权利要求1或2所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述耐高温限制性内切酶包括TspRⅠ内切酶。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液；优选地，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、dNTP、PCR反应缓冲液和水；优选地，所述DNA聚合酶包括高保真DNA聚合酶。5.一种富集PIK3CA基因突变区片段的方法，其特征在于，所述方法包括：取待测样本DNA作为模板，利用权利要求1
‑
4任一项所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒中正义引物和反义引物进行PCR扩增，在PCR扩增产物中加入耐高温限制性内切酶，进行酶切反应，利用酶切反应产物继续进行PCR扩增。6.根据权利要求5所述的富集PIK3CA基因突变区片段的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：93～98℃预变性3～8min；93～98℃变性25～35sec，50～55℃退火25～35sec；70～75℃延伸25～35sec，10～20个循环；优选地，所述酶切反应的条件为60～70℃反应0.5～2h。7.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测PIK3CA基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求5或6所述的富集PIK3CA基因突变区片段的方法富集待测样本中PIK3CA基因突变区片段，对富集产物进行测序，根据测序结果进行对比分析，判断待测样本是否存在突变。8.根据权利要求7所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测PIK3CA基因突变的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗迪贤，文小莎，刘权，
申请(专利权)人：华中科技大学协和深圳医院，
类型：发明
国别省市：