一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用。本发明专利技术设计针对不同的免疫球蛋白链的内掺参考物制备方法，能够对不同的免疫球蛋白链定制不同的内掺参考物，从而对目标克隆序列进行全面的相对定量分析，能够稳定得到读序（reads）数目和数字PCR定量的拷贝数之间的皮尔逊（Pearson）相关系数>0.99，针对每类免疫球蛋白链定制的内掺参考物对不同的目标克隆重排序列均可进行相对定量，具有普适性，无须针对每种重排序列逐一单独开发定量方法，适合下一代高通量测序法，成本低，可操作性强。可操作性强。可操作性强。

【技术实现步骤摘要】
一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]B细胞受体（BCR）及T细胞受体（TCR）是免疫细胞特异性识别抗原和产生特异性抗体的重要分子，其本质是一种膜表面免疫球蛋白。BCR由4条多肽链（2条重链和2条轻链）组成，TCR由两条（TCRαβ和TCRγδ）多肽链组成，BCR和TCR的重链和轻链都有可变区（V区）和恒定区（C区）组成，不同细胞（克隆）的恒定区可以相同，但可变区是不同的。重链的可变区是由胚系BCR或TCR基因的V基因片段、D基因片段及J基因片段通过随机重组而成，轻链的可变区是由V基因片段和J基因片段重组而成。每个成熟的B细胞和T细胞只含有1种确定的V
‑
D
‑
J或V
‑
J组合，即每种BCR或TCR都对应着唯一的重排组合，因此可以通过V
‑
D
‑
J或V
‑
J重排鉴定或追踪特定细胞克隆。
[0003]在血液肿瘤疾病中，免疫细胞往往会呈现出单克隆性，即某一种肿瘤细胞大量增殖。因此，可以通过鉴定某种特殊的V
‑
D
‑
J或V
‑
J重排来判断肿瘤细胞的主克隆形式，并通过跟踪这种重排形式来评估肿瘤细胞的残留情况，即微小残留病(minimal residual disease，MRD)。通常临床利用白血病细胞和正常细胞间抗原表达异常区分白血病细胞和正常细胞，是目前应用最广泛、最快速的方法。但是只有那些和正常细胞（包括正常幼稚细胞）间存在明显不重叠差别的抗原或抗原组合才能用于MRD监测；并且常规的流式细胞法检测的敏感性只有10
‑4；同时白细胞表面抗原的免疫漂移现象会干扰MRD的检测。将高通量的NGS技术应用于MRD检测，针对BCR或TCR（BCR/TCR）基因重排，可获得所有的BCR/TCR克隆重排碱基序列，灵敏度可达10
‑6，并且样本投入量只需要新一代流式细胞术同等灵敏度下的十分之一，且不需要严格要求是新鲜的样本，一次性可以监测所有克隆重排和免疫重建，更易标准化，具有较大的临床应用前景。目前常规的NGS检测MRD方法是采用多重扩增子测序，即通过一套引物组将所有的V
‑
D
‑
J或V
‑
J的重排形式扩增出来，然后上机进行高通量测序。通过分析肿瘤细胞相应的V
‑
D
‑
J或V
‑
J重排的读序（reads）数目有无来判断是否有肿瘤细胞残留，但是却无法计算MRD水平来评估患者的预后。
[0004]综上所述，提供一种适用于NGS法的BCR/TCR重排定量检测方法，可有效地对肿瘤细胞克隆数目进行相对定量，从而准确计算出对应的MRD水平，对于免疫球蛋白链基因重排检测检测及微小残留病检测领域具有重要意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用，能够对不同的免疫球蛋白链进行定制不同的内掺参考物，从而对目标克隆序列进行全面的相对定量分析。针对每类免疫球蛋白链定制的内掺参
考物对不同的目标克隆重排序列均可进行相对定量，具有普适性，无须针对每种重排序列逐一单独开发定量方法，适合下一代高通量测序法，成本低，可操作性强。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物（spike
‑
in）的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0008]（1）构建或筛选具有目标重排链的细胞系组合；
[0009]（2）分别提取所述细胞系组合中各细胞系基因组DNA；
[0010]（3）对所述细胞系组合中各细胞系中的目标重排链序列进行定值拷贝数；
[0011]（4）对不同的细胞系设置不同的拷贝数水平，依据定值拷贝数结果取对应量的细胞系基因组DNA与稳定剂混合，并用稀释液稀释至相应拷贝数浓度，获得所述内掺参考物。
[0012]本专利技术中，设计了针对不同的免疫球蛋白链的内掺参考物制备方法，以进行对目标克隆序列的定量分析，能够稳定得到读序（reads）数目和数字PCR定量的拷贝数之间的皮尔逊（Pearson）相关系数>0.99，从而规范化校准目标克隆序列的拷贝数，实现对肿瘤细胞克隆的定量。该方法毋须针对每种重排序列逐一单独开发定量方法，对不同的免疫球蛋白链重排及不同的目标克隆序列具有普适性，可操作性强，重复性好；同时，和常规内参基因校准相比，不受PCR引物和PCR扩增效率的影响，稳定性好，能够实现对低水平肿瘤细胞克隆的高灵敏度、高准确度的定量。
[0013]优选地，所述目标重排链包括IgH、Igκ、Igλ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ中任意一种或至少两种的组合。
[0014]优选地，所述细胞系组合中包含至少三种同一类免疫球蛋白链的重排序列。
[0015]优选地，所述细胞系为淋系血液肿瘤标准细胞系。
[0016]优选地，用于BCR重排定量的细胞系选自MEC
‑
1、REH、IM
‑
9、SUP
‑
B15、SUP
‑
B8、U266B1、TOM
‑
1或MN
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60中的任意一种或至少两种的组合。
[0017]优选地，用于TCR重排定量的细胞系选自Jurkat、MOLT
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4、MOLT
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13、MOLT
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16、SUP
‑
T1、SUP
‑
T3、HUT78或HUT102中的任意一种或至少两种的组合。
[0018]优选地，步骤（2）还包括对所述各细胞系基因组DNA进行稀释的步骤；
[0019]优选地，所述稀释的终浓度为5~15 ng/
µ
L，包括但不限于6 ng/
µ
L、7 ng/
µ
L、8 ng/
µ
L、9 ng/
µ
L、10 ng/
µ
L、12 ng/
µ
L、13 ng/
µ
L或14 ng/
µ
L。
[0020]优选地，所述不同的细胞系的拷贝数水平各自独立地为10~1000拷贝，包括但不限于11拷贝、12拷贝、13拷贝、14拷贝、15拷贝、16拷贝、17拷贝、18拷贝、19拷贝、30拷贝、50拷贝、100拷贝、300拷贝、400拷贝、500拷贝、800拷贝、900拷贝、950拷贝、960拷贝、970拷贝、980拷贝、990拷贝、995拷贝、998拷贝或999拷贝。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：（1）构建或筛选具有目标重排链的细胞系组合；（2）分别提取所述细胞系组合中各细胞系基因组DNA；（3）对所述细胞系组合中各细胞系中的目标重排链序列进行定值拷贝数；（4）对不同的细胞系设置不同的拷贝数水平，依据定值拷贝数结果取对应量的细胞系基因组DNA与稳定剂混合，并用稀释液稀释至相应拷贝数浓度，获得所述内掺参考物。2.根据权利要求1所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，所述目标重排链包括IgH、Igκ、Igλ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ中任意一种或至少两种的组合；所述细胞系组合中包含至少三种同一类免疫球蛋白链的重排序列；所述细胞系为淋系血液肿瘤标准细胞系；用于BCR重排定量的细胞系选自MEC
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1、REH、IM
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9、SUP
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B15、SUP
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B8、U266B1、TOM
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1或MN
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60中的任意一种或至少两种的组合；用于TCR重排定量的细胞系选自Jurkat、MOLT
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4、MOLT
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13、MOLT
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16、SUP
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T1、SUP
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T3、HUT78或HUT102中的任意一种或至少两种的组合。3.根据权利要求1所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，步骤（2）还包括对所述各细胞系基因组DNA进行稀释的步骤；所述稀释的终浓度为5~15 ng/
µ
L。4.根据权利要求1所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，所述不同的细胞系的拷贝数水平各自独立地为10~1000拷贝；所述拷贝数水平设置三个梯度，第一梯度拷贝数水平为10~30拷贝，第二梯度拷贝数水平为80~120拷贝，第三梯度拷贝数水平为600~1000拷贝；所述拷贝数浓度为目标拷贝数水平除以2
ꢀµ
L。5.根据权利要求1所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，所述稳定剂包括鲑鱼精DNA；所述稳定剂的终浓度为40~60 ng/
µ
L；所述稀释液包括TE缓冲液；步骤（4）后还包括对所述内掺参考物中目标重排链序列进行定值拷贝数的步骤。6.根据权利要求1所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾凯丽，刘佳，冯瑞杰，王方杰，张亚飞，
申请(专利权)人：迈杰转化医学研究苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：