一种副溶血性弧菌和大肠杆菌O157:H7标准质粒、构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种副溶血性弧菌和大肠杆菌O157：H7标准质粒、制备方法及其应用。本发明专利技术的副溶血性弧菌标准质粒样品采用副溶血性弧菌tlh、trh、toxR、gyrB、groEL基因以及自筛高特异靶基因VPA1585，使用重叠延伸PCR将特异性扩增片段串联并克隆至pUC19质粒形成；大肠杆菌O157：H7标准质粒样品采用大肠杆菌O157：H7 rfbE、fliC、stx1、stx2以及自筛高特异靶基因ECS2840，使用重叠延伸PCR将特异性扩增片段串联并克隆至pUC19质粒形成。本发明专利技术制备的标准质粒序列来源清晰、纯度高且应用能力良好，可应用于食源性致病菌核酸检测，为副溶血性弧菌、大肠杆菌O157：H7检测获得准确、可靠、具有可比性的检测结果提供保障。可比性的检测结果提供保障。可比性的检测结果提供保障。

【技术实现步骤摘要】
一种副溶血性弧菌和大肠杆菌O157:H7标准质粒、构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于食源性致病菌检测领域，具体涉及一种副溶血性弧菌和大肠杆菌O157：H7标准质粒、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种引起沿海地区食源性疾病的主要病原菌，广泛分布在海洋环境中，经常从各种生海鲜中分离出来，食用被副溶血性弧菌污染的食物会引发腹泻、头痛、呕吐、恶心、腹部绞痛和低热等症，严重时会出现败血症甚至危及生命安全。大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是肠出血性大肠杆菌的代表菌株。感染大肠杆菌O157:H7可导致广泛的临床表现，包括无症状感染、轻度腹泻或严重疾病，如出血性结肠炎和溶血尿毒症综合征等。
[0003]目前针对副溶血性弧菌和大肠杆菌O157:H7较为普遍且易行的检测方法为基于核酸的分子生物学方法，如普通PCR、荧光PCR、环介导等温扩增等。此类方法的精准度和特异性主要依赖于检测靶点的选择。目前副溶血性弧菌常用检测靶基因集中于gyrB、toxR、trh、tdh、tlh及groEL基因等有限的几种，前期试验表明，这些基因的检测准确率均达不到100％，存在一定的误检率和漏检率。大肠杆菌O157:H7常用检测靶点主要包含rfbE、fliC、stx1、stx2以及其他毒力基因，而fliC、rfbE、stx1、stx2的特异性较差，在大肠杆菌O157:H7中的覆盖率分别为81.80％、90.90％、36.40％、54.50％，在非O157:H7菌株中也有检出。针对以上问题，亟须发掘新的特异性新靶点进行补充。本专利技术前期针对副溶血性弧菌和大肠杆菌O157:H7，通过生物信息学技术分别筛选到了高特异性靶基因，并且在供试菌株中表现出100％的特异性。在实际应用中仅仅依赖一种靶基因鉴定致病菌是困难的，多个靶基因联合使用可以弥补单基因检测的不足，更加准确和有效鉴定致病菌。
[0004]目前，核酸检测过程中，检测结果的可靠性、准确性、可对比性离不开阳性标准物质。质粒标准样品是一类含有检测靶基因特异性片段的重组质粒分子，具有可大量培养、稳定性好、定量简单、易于生产和制备和纯度高等优点，可作为核酸定性检测中的阳性对照。目前质粒标准样品的研究相对缺乏，且常用检测靶基因难以满足现现实需求，本专利技术分别将副溶血性弧菌和大肠杆菌O157:H7核酸检测中主要的靶基因与自筛靶基因串联制备成多靶基因标准质粒，覆盖率广、特异性强，可结合多种分子生物学检测方法进行副溶血性弧菌和大肠杆菌O157:H7的定性检测，为致病菌检测的质量控制提供了有力保障，具有重要的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了副溶血性弧菌和大肠杆菌O157：H7标准质粒，并公开了副溶血性弧菌和大肠杆菌O157：H7标准质粒构建方法及其应用，为质粒标准品的制备和应用提供重要参考，为食源性致病菌快速核酸检测提供技术支持。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种标准质粒样品，选自(1)或(2)：
[0008](1)副溶血性弧菌标准质粒样品：
[0009]采用副溶血性弧菌tlh、trh、toxR、gyrB、groEL基因及自筛靶基因VPA1585的特异性扩增片段串联并克隆至pUC19质粒形成副溶血性弧菌标准质粒样品，所述副溶血性弧菌标准质粒样品的插入片段核苷酸序列如SEQ ID No.1～6所示；
[0010](2)大肠杆菌O157:H7的标准质粒样品：
[0011]采用大肠杆菌O157：H7的rfbE、fliC、stx1、stx2以及自筛靶基因ECS2840的特异性扩增片段串联并克隆至pUC19质粒形成；所述大肠杆菌O157:H7的标准质粒样品的插入片段核苷酸序列如SEQ ID No.7～11所示。
[0012]在一些具体的实施方案中，在260nm和280nm处的光密度比值在1.8
‑
2.0之间，浓度经picogreen试剂盒定量至100ng/μL。
[0013]第二方面，本专利技术还保护一种标准质粒样品的制备方法，其包括：
[0014]步骤1，PCR扩增获得副溶血性弧菌tlh、trh、toxR、gyrB、VPA1585及groEL基因特异性扩增片段，或，PCR扩增获得大肠杆菌O157：H7的rfbE、fliC、stx1、stx2及ECS2840基因特异性扩增片段；
[0015]步骤2，使用重叠延伸PCR将特异性扩增片段串联；
[0016]步骤3，克隆至pUC19载体中，经大肠杆菌DH5α扩大培养，提取并提纯质粒；
[0017]步骤4，测定浓度和质量并分装，即所述副溶血性弧菌或大肠杆菌O157:H7的标准质粒。
[0018]在一些具体的实施方案中，所述方法还包括对标准质粒的核酸定性验证，通过特异性引物进行PCR扩增和测序分析，来确认所制备的标准质粒包括准确的目的序列。
[0019]第三方面，本专利技术还保护前文所述的标准质粒样品，在下述的应用：
[0020](1)当标准质粒样品为副溶血性弧菌标准质粒样品时，所述应用选自如下(A1)
‑
(A4)：
[0021](A1)检测副溶血性弧菌；
[0022](A2)制备用于检测副溶血性弧菌的产品；
[0023](A3)确认待测样品是否含有副溶血性弧菌；
[0024](A4)制备确认待测样品是否含有副溶血性弧菌的产品；
[0025](2)当标准质粒样品为大肠杆菌O157：H7标准质粒样品时，所述应用选自如下(B1)
‑
(B4)：
[0026](B1)检测大肠杆菌O157：H7；
[0027](B2)制备用于大肠杆菌O157：H7的产品；
[0028](B3)确认待测样品是否含有大肠杆菌O157：H7检测；
[0029](B4)制备确认待测样品是否含有大肠杆菌O157：H7的产品。
[0030]在一些具体的实施方案中，在进行副溶血性弧菌和大肠杆菌O157:H7检测时，所述标准质粒作为参考品或对照品。
[0031]有益效果
[0032]本专利技术具有以下有益效果：
[0033](1)本专利技术提供一种标准质粒样品的构建方法，使用重叠延伸PCR实现多个特异性扩增片段串联并克隆至质粒载体，简单高效。
[0034](2)本专利技术用于检测副溶血性弧菌的参考品针对副溶血性弧菌tlh、trh、toxR、gyrB、VPA1585及groEL基因的检测，提供统一参考品。
[0035](3)本专利技术用于检测大肠杆菌O157：H7的参考品针对大肠杆菌O157：H7rfbE、fliC、stx1、stx2及ECS2840基因的检测，提供统一参考品。
[0036](4)相对于传统基因组参考样品，多基因联用、序列来源清晰、定量简单、易于生产制备和纯度高，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.标准质粒样品，选自（1）或（2）：（1）副溶血性弧菌标准质粒样品：采用副溶血性弧菌tlh、trh、toxR、gyrB、groEL基因及自筛靶基因VPA1585的特异性扩增片段串联并克隆至 pUC19 质粒形成副溶血性弧菌标准质粒样品，所述副溶血性弧菌标准质粒样品的插入片段核苷酸序列如SEQ ID No.1~6 所示；（2）大肠杆菌 O157:H7 的标准质粒样品：采用大肠杆菌 O157：H7的rfbE、fliC、stx1、stx2以及自筛靶基因ECS2840的特异性扩增片段串联并克隆至 pUC19 质粒形成；所述大肠杆菌 O157:H7的标准质粒样品的插入片段核苷酸序列如SEQ ID No.7~11 所示。2.根据权利要求1所述的标准质粒样品，其特征在于，在260nm和280nm处的光密度比值在1.8
‑
2.0之间，浓度经picogreen试剂盒定量至100ng/μL。3.一种权利要求1
‑
2任一项所述的标准质粒样品的制备方法，其特征在于，包括：步骤1，PCR扩增获得副溶血性弧菌tlh、trh、toxR、gyrB、VPA1585及groEL基因特异性扩增片段，或，PCR扩增获得大肠杆菌O157：H7的rfbE、fliC、stx1、stx2及ECS2840基因特异性扩增片段；步骤2，使用重叠延伸PCR将...

【专利技术属性】
技术研发人员：别小妹，崔心平，杨军，陆兆新，周海波，胡安妥，孔梁宇，刘新梅，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：