一种副溶血性弧菌和大肠杆菌O157:H7标准质粒、构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种副溶血性弧菌和大肠杆菌O157：H7标准质粒、制备方法及其应用。本发明专利技术的副溶血性弧菌标准质粒样品采用副溶血性弧菌tlh、trh、toxR、gyrB、groEL基因以及自筛高特异靶基因VPA1585，使用重叠延伸PCR将特异性扩增片段串联并克隆至pUC19质粒形成；大肠杆菌O157：H7标准质粒样品采用大肠杆菌O157：H7 rfbE、fliC、stx1、stx2以及自筛高特异靶基因ECS2840，使用重叠延伸PCR将特异性扩增片段串联并克隆至pUC19质粒形成。本发明专利技术制备的标准质粒序列来源清晰、纯度高且应用能力良好，可应用于食源性致病菌核酸检测，为副溶血性弧菌、大肠杆菌O157：H7检测获得准确、可靠、具有可比性的检测结果提供保障。可比性的检测结果提供保障。可比性的检测结果提供保障。

【技术实现步骤摘要】
一种副溶血性弧菌和大肠杆菌O157:H7标准质粒、构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于食源性致病菌检测领域，具体涉及一种副溶血性弧菌和大肠杆菌O157：H7标准质粒、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种引起沿海地区食源性疾病的主要病原菌，广泛分布在海洋环境中，经常从各种生海鲜中分离出来，食用被副溶血性弧菌污染的食物会引发腹泻、头痛、呕吐、恶心、腹部绞痛和低热等症，严重时会出现败血症甚至危及生命安全。大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是肠出血性大肠杆菌的代表菌株。感染大肠杆菌O157:H7可导致广泛的临床表现，包括无症状感染、轻度腹泻或严重疾病，如出血性结肠炎和溶血尿毒症综合征等。
[0003]目前针对副溶血性弧菌和大肠杆菌O157:H7较为普遍且易行的检测方法为基于核酸的分子生物学方法，如普通PCR、荧光PCR、环介导等温扩增等。此类方法的精准度和特异性主要依赖于检测靶点的选择。目前副溶血性弧菌常用检测靶基因集中于gy本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.标准质粒样品，选自（1）或（2）：（1）副溶血性弧菌标准质粒样品：采用副溶血性弧菌tlh、trh、toxR、gyrB、groEL基因及自筛靶基因VPA1585的特异性扩增片段串联并克隆至 pUC19 质粒形成副溶血性弧菌标准质粒样品，所述副溶血性弧菌标准质粒样品的插入片段核苷酸序列如SEQ ID No.1~6 所示；（2）大肠杆菌 O157:H7 的标准质粒样品：采用大肠杆菌 O157：H7的rfbE、fliC、stx1、stx2以及自筛靶基因ECS2840的特异性扩增片段串联并克隆至 pUC19 质粒形成；所述大肠杆菌 O157:H7的标准质粒样品的插入片段核苷酸序列如SEQ ID No.7~11 所示。2.根据权利要求1所述的标准质粒样品，其特征在于，在260nm和280nm处的光密度比值在1.8
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2.0之间，浓度经picogreen试剂盒定量至100ng/μL。3.一种权利要求1
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2任一项所述的标准质粒样品的制备方法，其特征在于，包括：步骤1，PCR扩增获得副溶血性弧菌tlh、trh、toxR、gyrB、VPA1585及groEL基因特异性扩增片段，或，PCR扩增获得大肠杆菌O157：H7的rfbE、fliC、stx1、stx2及ECS2840基因特异性扩增片段；步骤2，使用重叠延伸PCR将...

【专利技术属性】
技术研发人员：别小妹，崔心平，杨军，陆兆新，周海波，胡安妥，孔梁宇，刘新梅，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：