一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽、制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽、制备方法及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术所述抗菌肽的氨基酸序列为Trp

【技术实现步骤摘要】
一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽、制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]猕猴桃由于其较高的营养价值，是世界范围内商业生产发展后重要的经济果树作物，中国是最大的猕猴桃生产国，其次是新西兰和意大利。目前由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae，Psa)引起的猕猴桃溃疡病，已造成严重损失，并严重威胁猕猴桃生产。猕猴桃溃疡病表现为独特的田间症状，如叶斑、花坏死、树枝枯梢、典型的躯干溃疡和红色或白色渗出物。Psa作为一种需氧革兰氏阴性植物病原体，该细菌具有高毒力和快速传播性能，由其引起的猕猴桃溃疡病难以控制，被欧洲植物保护组织认为是一种检疫性病原体。
[0003]目前已经开发了各种方法来限制Psa的传播，包括定期监测、去除受感染的植物体、喷洒抗生素以及使用生物防治剂和宿主抗性诱导子。尽管化学控制已被广泛用于控制猕猴桃溃疡病，但过度依赖化学品(如链霉素和铜制剂)会导致环境污染、抗生素残留和病原体抗性等问题。虽然现有生物防治剂中有用抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)用于抑菌研究的，但是抗菌肽抑菌活性低且分子量大，而在Psa防治中未见相关报道，AMPs对Psa的作用机制尚不清楚，AMPs是否在植株体内仍具有抗Psa活性尚不明确。

技术实现思路

[0004]针对上述存在问题，本专利技术提供了一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽、制备方法及其应用，所述抗菌肽在体内体外对猕猴桃溃疡病菌均具有较高的抗菌活性，作用机制独特、溶血活性低、不诱发耐药性。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列为Trp
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Trp
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Lys
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Leu
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Leu
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Arg
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Lys
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Leu
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NH2，其序列特征为含有8个氨基酸残基且羧基端酰胺化修饰。
[0007]优选的，所述抗菌肽的分子量为1140.4Da，等电点为12.4，带有+4电荷，疏水性为33.60，具有典型的两亲性结构。
[0008]本专利技术提供所述抗菌肽的制备方法是利用Fmoc多肽固相合成的方法从C端到N端人工合成抗菌肽，包括如下步骤：将Rink树脂进行Fmoc脱除处理，然后与氨基酸混合偶联，重复氨基酸偶联步骤的操作，按照所述抗菌肽序列依次加入相应的氨基酸，直至多肽合成完毕。
[0009]优选的，所述氨基酸的加入量是Rink树脂用量的4倍。
[0010]本专利技术提供所述抗菌肽在制备防治猕猴桃溃疡病菌药物中的应用。
[0011]优选的，所述抗菌肽对猕猴桃溃疡病菌的最小抑菌浓度为3.13μg/mL，半最大有效
浓度为1.67μg/mL。
[0012]优选的，所述药物包括除所述抗菌肽以外的不影响抗菌肽活性的其他组分。
[0013]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0014]本专利技术首次利用Fmoc多肽固相合成的方法从C端到N端人工合成所述抗菌肽Trp
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Trp
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Lys
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Leu
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Leu
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Arg
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Lys
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Leu
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NH2，并指出该抗菌肽的分子量为1140.4Da，等电点为12.4，带有+4电荷，疏水性为33.60，具有典型的两亲性结构，碱性氨基酸聚集在同一边。相对于现有抑菌活性的抗菌肽分子量小，易于人工合成，降低了人工合成成本。
[0015]本专利技术首次发现所述抗菌肽具有抑制Psa的作用，其中色氨酸(Trp，W)的融合芳香环更倾向于微生物的膜界面，精氨酸(Arg，R)的加入可以提高抗菌活性，增强抗菌肽包埋到Psa细胞膜中。该抗菌肽在体内、体外均可有效抑制Psa，可作为杀菌剂应用于猕猴桃溃疡病菌的防治。
附图说明
[0016]图1抗菌肽纯度(a)和分子量(b)检测结果。
[0017]图2抗菌肽的螺旋轮图(a)和空间结构(b)。
[0018]图3抗菌肽对Psa细胞膜通透性(a)和钙离子渗漏(b)的影响结果(Control：PBS，不同的字母表示不同处理间的显著性差异：P<0.05)。
[0019]图4抗菌肽对Psa细胞膜去极化的影响结果(不同的字母表示不同处理间的显著性差异：P<0.05)。
[0020]图5抗菌肽处理后Psa细胞的SEM(a
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d)和TEM(e
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i)观察结果(a和d：对照(无菌水))。
[0021]图6抗菌肽的定位(a)、抗菌肽与DNA结合活性(b)以及抗菌肽对DNA复制和修复基因表达的影响(c)结果(不同的字母表示不同处理间的显著性差异：P<0.05)。
[0022]图7抗菌肽对Psa细胞内ROS(a)和细胞内酯酶活性(b)的影响结果(不同的字母表示不同处理间的显著性差异：P<0.05)。
[0023]图8抗菌肽对感染Psa猕猴桃体内抗菌活性的影响结果(不同的字母表示不同处理间的显著性差异：P<0.05)。
[0024]图9抗菌肽的溶血活性检测结果。
具体实施方式
[0025]本专利技术提供了一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列为Trp
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Trp
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Lys
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Leu
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Leu
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Arg
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Lys
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Leu
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NH2(WWKLLRKL
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NH2)，其序列特征为含有8个氨基酸残基且羧基端酰胺化修饰。本专利技术所述抗菌肽未进行酰胺化修饰的8个氨基酸组成的序列为Trp
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Trp
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Lys
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Leu
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Leu
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Arg
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Lys
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Leu(WWKLLRKL)如SEQ ID NO.1所示。本专利技术所述抗菌肽的分子量为1140.4Da，等电点为12.4，带有+4电荷，疏水性为33.60，具有典型的两亲性结构，碱性氨基酸聚集在同一边。本专利技术所述抗菌肽为白色粉末，溶于水，纯度大于95％。
[0026]本专利技术提供所述抗菌肽的制备方法，所述制备方法是利用Fmoc多肽固相合成的方法从C端到N端人工合成抗菌肽。本专利技术所述抗菌肽的具体制备方法包括如下步骤：(1)选用Rink树脂进行多肽合成：将Rink树脂加入固相反应器中，然后向固相反应器加入PIP(哌
啶)/DMF(二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种防治猕猴桃溃疡病菌的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为Trp
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Trp
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Lys
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Leu
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Leu
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Arg
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Lys
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Leu
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NH2，其序列特征为含有8个氨基酸残基且羧基端酰胺化修饰。2.如权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的分子量为1140.4Da，等电点为12.4，带有+4电荷，疏水性为33.60，具有典型的两亲性结构。3.如权利要求1或2所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：党向利，王丽芳，张铭宇，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：