快速高效鉴定花生青枯病抗性的水培接种方法技术

本发明专利技术涉及一种花生青枯病抗性的鉴定方法。快速高效鉴定花生青枯病抗性的水培接种方法，其特征在于包括如下步骤：1)、花生水培体系的建立：种子在蛭石中萌发；生长环境为添加1.1g/L MS培养基的水培液；2)、混合菌接种：将花生青枯菌株HA1、HA2和MC1分别培养，等浓度等体积混合后稀释到1*107CFU/ml接种花生；调查并计算存活率；3)、抗病性鉴定：存活率大于90％时，为高抗品种；存活率为80％～90％，为抗病品种；存活率为70％～80％，为中抗品种；存活率为50％～70％，为感病品种；存活率<50％，为高感品种。该方法所需时间短，方法简便，不受季节和田间的限制，较为准确的反映花生材料的抗性表现。现。现。

【技术实现步骤摘要】
快速高效鉴定花生青枯病抗性的水培接种方法


[0001]本专利技术涉及一种花生青枯病抗性的鉴定方法，具体涉及一种快速高效鉴定花生青枯病抗性的水培接种方法。

技术介绍

[0002]花生(Arachis hypogaea L)是我国重要的油料和经济作物之一，根据国家统计局发布的数据，2020年全国花生种植面积达到4780.83万公顷，总产达到1799.27万吨，不断创造历史新高。然而，我国花生受青枯病危害普遍较重，这种由雷尔氏青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起的土传细菌病害在长江流域及以南的广大花生产区以及北方局部产区均有发生，病地约占全国花生种植面积的1/10，危害面积居世界首位。花生青枯病从苗期到收获期均可发生，尤其以开花期最重，受害田块一般减产10％～30％，发病严重地块可导致绝收。由于青枯菌能在土壤中存活多年，防治难度大，最经济有效的防控措施是种植抗病花生品种。
[0003]花生青枯病抗性的鉴定技术自上世纪七十年代以来不断完善，相继建立了田间自然病圃法、浸种法、针刺法、剪叶法等技术。其中，田间自然病圃法和浸种法被广泛采用，这两种方法一般在花生生长期进行，根据中期和收获前的植株存活率来确定抗病性。但是，全生育期鉴定需要的时间较长，一般长达4～5个月，大部分地区一年只能鉴定一次。同时，田间鉴定结果受土壤类型、地形地貌、降雨量和温度等因素的影响较大，尤其降雨量偏少的干旱胁迫，会导致病害整体较轻。此外，田间鉴定还易受到其他土传枯萎病害的干扰，导致结果不准确。因此，为快速鉴定大量花生种质资源材料，需要建立更为简便、快捷、稳定的高通量抗性鉴定方法。
[0004]水培法在许多作物青枯病抗性鉴定中得到应用。吕建伟等(2012)初步利用两个抗、感花生品种尝试了水培法接种，可有效区分花生的抗性，但未见应用于规模化鉴定。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种快速高效鉴定花生青枯病抗性的水培接种方法，该方法所需时间短、简便。
[0006]为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：快速高效鉴定花生青枯病抗性的水培接种方法，其特征在于包括如下步骤：
[0007]1)、花生水培体系的建立
[0008]将花生品种播种到蛭石中，28℃
±
2℃条件下，16h光照+8h黑暗培养至下胚轴的长度为3～5cm，用海绵包裹住种子下胚轴固定在直径为2cm的多孔板上，将放满种子的多孔板盖在装满水的塑料盒上，每7d(七天)换水一次；在花生植株生长到6叶期时在水培盆中添加植物组织培养基本培养基MS(Murashige&Skoog)(DuchefaBiochemie公司)，设置终浓度为1.1g/L～2.2g/L；
[0009]2)、混合菌接种
[0010]青枯菌培养：将
‑
80℃保存的花生青枯菌株随机选取HA1、HA2和MC1分别划线培养于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)上，30℃下培养两天至菌落长出，挑取单菌落分别接种于5mL马铃薯葡萄糖液体培养基(potato dextrose broth,PDB)中，200r/min振荡培养24h后，吸取1mL加入到100mL马铃薯葡萄糖液体培养基(potato dextrose broth,PDB)中继续200r/min振荡培养48h，取1mL菌液利用NanoDrop one超微量分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)测定OD600值(OD600＝1相当于1
×
109CFU/ml)(Caldwell et al2017)，并将菌株分别稀释到1
×
107CFU/ml，然后将三个菌株等体积混合(所述三个菌株为：花生青枯菌株HA1、花生青枯菌株HA2和花生青枯菌株MC1分别培养得到的)，得到浓度为1
×
107CFU/ml的青枯菌混合菌液；
[0011]青枯菌接种：将步骤1)中水培条件下5～6叶期的花生植株取出，剪掉距离茎基部10cm以下的根系，将花生植株下部浸泡于1
×
107CFU/ml的青枯菌混合菌液中30min，再将花生植株转移至新鲜的无菌水中培养至枯萎症状显现；从枯萎症状显现开始，每天记录枯萎植株数，计算存活率，存活率＝(1
‑
枯萎株数/总株数)
×
100％。
[0012]3)、抗病性的鉴定
[0013]存活率大于90％时，为高抗品种；存活率为80％～90％，为抗病品种；存活率为70％～80％，为中抗品种；存活率为50％～70％，为感病品种；存活率<50％，为高感品种。
[0014]进一步地，步骤1)中，塑料盒的长
×
宽
×
高：35
×
24.5
×
9.5
㎝
。
[0015]相对于其它室内接种方法，水培法鉴定中病菌从根部侵染花生植株，进而扩展到下胚轴、茎枝基部甚至中上部，更接近于田间自然发病过程；其次，水培法鉴定的生长和发病条件容易控制，环境一致性好，不受气候条件影响；再次，水培法鉴定的过程比田间自然病圃鉴定时间短，仅需30～45天，且可以周年多次进行。据此，本研究从花生催芽方式、水培溶液营养物质的优化、单菌与混合菌接种的比较、接种的浓度、接种后发病的动态等方面对水培鉴定方法进行了系统试验，并通过与田间自然病圃鉴定结果的比较，明确了水培鉴定方法的准确性和适用性，建立了花生水培伤根蘸菌法快速鉴定青枯病抗性的高通量技术。
[0016]本专利技术创新点1：蛭石萌发代替培养皿萌发，或者更直的培根，便于操作。本专利技术创新点2：水培条件下添加了植物组织培养基础培养基(MS营养基)，保障植株正常生长需要的营养。本专利技术创新点3：利用混菌接种，以前没有被报道。本专利技术创新点4：通过水培法与自然病圃法的比较，验证方法的有效性和可靠性。
[0017]本专利技术的有益效果是：1、该方法鉴定花生青枯病抗性所需时间短，整个周期30～45d。2、本专利技术的方法简便。3、本专利技术的方法，不受季节和田间的限制，较为准确的反映花生材料的抗性表现，有助于快速高效进行大量花生材料青枯病抗性筛选工作。
附图说明
[0018]图1是本专利技术分离的青枯菌特异引物PCR扩增片段图。
[0019]图2是本专利技术种子在不同条件下萌发图片及胚根长度柱状图。图2中，A：中花12萌发48h形态；B：中花12萌发48h胚根长度；C：中花21萌发48h形态；D：中花12萌发48h胚根长度；P：培养皿中萌发；V：蛭石中萌发。
[0020]图3是本专利技术添加MS对植株生长的影响图。图3中，A：对照和添加MS对花生生长的影响；B：花生主茎长度。
[0021]图4是本专利技术混合菌液接种抗、感花生后枯萎率的变化图。图4中，A：1
×
108CFU/ml；B：1
×
107CFU/ml。
[0022]图5是本专利技术抗、感病品种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.快速高效鉴定花生青枯病抗性的水培接种方法，其特征在于包括如下步骤：1)、花生水培体系的建立将花生品种播种到蛭石中，28℃
±
2℃条件下，16h光照+8h黑暗培养至下胚轴的长度为3～5cm，用海绵包裹住种子下胚轴固定在直径为2cm的多孔板上，将放满种子的多孔板盖在装满水的塑料盒上，每七天换水一次；在花生植株生长到6叶期时在水培盆中添加植物组织培养基本培养基MS(Murashige&Skoog)，设置终浓度为1.1g/L～2.2g/L；2)、混合菌接种青枯菌培养：将
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80℃保存的花生青枯菌株HA1、花生青枯菌株HA2和花生青枯菌株MC1分别划线培养于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)上，30℃下培养两天至菌落长出，挑取单菌落分别接种于5mL马铃薯葡萄糖液体培养基(potato dextrose broth,PDB)中，200r/min振荡培养24h后，吸取1mL加入到100mL马铃薯葡萄糖液体培养基(potato dextrose broth,PDB)中继续200r/min振荡培养48h，取1mL菌液利用NanoDrop one超微量分光光度计测定OD600值(OD600＝1相当于1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：晏立英，廖伯寿，雷永，宋万朵，罗怀勇，姜慧芳，康彦平，陈玉宁，淮东欣，王欣，王志慧，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：