一种胆囊癌类器官异种移植瘤模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及类器官领域，公开了一种胆囊癌类器官异种移植瘤模型的构建方法和应用，构建方法包括以下步骤：将肿瘤组织消化、清洗、红细胞裂红后，加入基质胶后，加入培养基培养得到原代胆囊癌类器官；将原代胆囊癌类器官消化、清洗、红细胞裂红后，加入基质胶，孵育、离心后，加入传代培养基培养；所述步骤S1或S2的培养基为5～25mM HEPES，15～25nM GlutaMAX，1～3％B27，50～200ng/mL A83

【技术实现步骤摘要】
一种胆囊癌类器官异种移植瘤模型的构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及类器官领域，尤其涉及一种胆囊癌类器官异种移植瘤模型的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]胆囊癌具有高度的侵袭性和化疗耐药性，缺少有效的化疗和靶向药治疗方案，寻找早期高敏靶标对胆囊癌的预防和治疗尤为重要，在胆囊癌中发生高频突变的有erbB、IDH、PIK3CA等。
[0003]目前没有接近于临床患者来源的胆囊癌模型，常用的模型为基于患者来源的胆囊癌异种移植物(PDX)模型，PDX虽然能够保留肿瘤的部分生物学特征，但存在成瘤周期长、失败率、无法解决穿刺等组织较小的样本建模的问题，影响胆囊癌的临床转化和基础研究。
[0004]类器官移植瘤小鼠模型(PDOX)是通过把体外扩增的类器官移植到免疫缺陷鼠建立的人源异种移植模型，可有效提高建模速度和成功率。PDOX模型主要集中在肺癌、卵巢癌、食管癌等，目前还没有含有不同突变、同步性好的胆囊癌PDOX模型。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的在于解决现有技术胆囊癌PDOX模型建模速度慢和成功率低的问题。
[0006]一种胆囊癌类器官异种移植瘤模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
[0007]S1，将肿瘤组织消化、清洗、红细胞裂红后，加入基质胶后，加入培养基培养得到原代胆囊癌类器官；
[0008]S2，将原代胆囊癌类器官消化、清洗、红细胞裂红后，加入基质胶，孵育、离心后，加入传代培养基培养；
[0009]所述步骤S1或S2的培养基为5～25mM HEPES，15～25nM GlutaMAX，1～3％ B27，50～200ng/mL A83
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01，20～80ng/mL EGF，80～120ng/mL Noggin，300～600ng/mL commercial R
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spondin1，5～15mM Y
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27632，0.5～2％ P/S，50～150μg/mL Primocin，200
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300nM SB202190，10～15ng/mL PGE2，10～30μg/mL FGF
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7，10～30μg/mL FGF
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10，基础液为Advanced DMEM/F12。
[0010]所述将肿瘤组织消化的消化液配方为1～3％青霉素/链霉素，0.05～0.2mg/mL庆大霉素，0.3～0.8％制酶菌素，1～4mg/mL胶原蛋白酶A，0.05～0.1mg/mL透明质酸酶以及基础液补充余量。
[0011]所述构建方法还包括以下步骤
[0012]S3、胆囊癌PDOX小鼠模型接种；
[0013]所述构建方法还包括以下步骤
[0014]S4、胆囊癌PDOX小鼠模型传代；
[0015]所述胆囊癌PDOX小鼠模型表达以下突变中的至少一种：erbB突变、IDH突变、
PIK3CA突变。
[0016]所述erbB2突变选自以下突变中的至少一种：S310F、S310Y、E265K、G292R、R678Q、V842I、L869R。
[0017]所述erbB3突变选自以下突变中的至少一种：V104L、V104M、R426W、D581N、P590H、R667S、E688Q、F965L、V1035D、S1234C。
[0018]本专利技术还涉及胆囊癌PDOX模型的构建方法的应用，用于建立靶向erbB突变、IDH突变或PIK3CA突变的药物的药效标准，所述癌症为结肠癌、直肠癌、食管癌、口腔癌、骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、白血病、神经内分泌肿瘤、肝癌、肾癌、胰腺癌、胃癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、软组织肉瘤、皮肤癌、十二指肠癌、肝内肝外胆管癌、脑胶质瘤，头颈鳞癌，滑膜肉瘤，喉乳头状瘤，鼻咽癌，胰腺神经内分泌瘤，子宫内膜癌，血管内皮瘤，输尿管肿瘤和甲状腺癌中的任一种。
[0019]本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：
[0020](1)本专利技术提供胆囊癌PDOX培养方法，以及以此构建得到的移植瘤模型，发现通过本专利技术提供的方法培养得到的原代胆囊癌类器官或传代胆囊癌类器官，以及后续接种到小鼠上得到的胆囊癌移植瘤和胆囊癌组织均呈球形或椭圆形，且蛋白表达一致，可很好保留体内肿瘤细胞的形态学、基因组学等信息，从而可有效研究表达不同突变的胆囊癌的机理、药物等研究。
[0021](2)且本专利技术体外扩增的过程操作简单，可视化程度高，通过2
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3次传代即可获得大量的类器官样本，且后续接种到多只小鼠体内，在保留了PDX模型的优势(如肿瘤微环境、肿瘤异质性)的同时，明显缩短了成瘤速度，整个模型建立过程简单易行。
[0022](3)此外，在进行原代培养、传代扩增以及小鼠模型接种过程中，通过控制胆囊癌单细胞和基质的用量，可避免目前胆囊癌类器官培养成功率差的问题，成瘤成功率高达80％
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90％，为临床转化提供了可行性。
[0023](4)本专利技术提供的模型具有在体外原代和传代培养中恶性程度高的类器官被有效富集的特性，促进了大批制作的实现以及同步性的提高，且促进了小鼠模型接种后移植瘤传代的稳定，可大批量进行后续的药物试验。
附图说明
[0024]图1为体外胆囊癌类器官生长状态图(采用motic AE2000拍摄，光镜4X物镜)。(左图为P1代，培养第3天；右图为P3代，培养第3天)。
[0025]图2为肿瘤组织(左)和第四代类器官(右)HE染色结果。
[0026]图3为组织(左)和第四代类器官(中)和第四代类器官接种得到的第一代PDOX(右)IHC组化同一Ki67染色标记对比图。
[0027]图4为组织(左)和第四代类器官(中)和第四代类器官接种得到的第一代PDOX(右)IHC组化同一P40染色标记对比图。
[0028]图5为组织(左)和第四代类器官(中)和第四代类器官接种得到的第一代PDOX(右)IHC组化同一P63染色标记对比图。
[0029]图6为组织(左)和第四代类器官(中)和第四代类器官接种得到的第一代PDOX(右)IHC组化同一CK5&6染色标记对比图。
[0030]图7为组织(左)和第四代类器官(中)和第四代类器官接种得到的第一代PDOX(右)IHC组化同一CK7染色标记对比图。
[0031]图8为组织(左)和第四代类器官(中)和第四代类器官接种得到的第一代PDOX(右)IHC组化同一CK
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19染色标记对比图。
[0032]图9为组织(左)和第四代类器官(中)和第四代类器官接种得到的第一代PDOX(右)IHC组化同一CgA染色标记对比图。
[0033]图10为组织(左)和第四代类器官(中)和第四代类器官接种得到的第一代PDOX(右)IHC组化同一Syn染色标记对比图。
[0034]图11为组织(左)和第四代类器官(中)和第四代本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胆囊癌类器官异种移植瘤模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：S1，将肿瘤组织消化、清洗、红细胞裂红后，加入基质胶后，加入培养基培养得到原代胆囊癌类器官；S2，将原代胆囊癌类器官消化、清洗、红细胞裂红后，加入基质胶，孵育、离心后，加入传代培养基培养；所述步骤S1或S2的培养基为5～25mM HEPES，15～25nM GlutaMAX，1～3％B27，50～200ng/mL A83
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01，20～80ng/mL EGF，80～120ng/mL Noggin，300～600ng/mL commercial R
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spondin1，5～15mM Y
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27632，0.5～2％P/S，50～150μg/mL Primocin，200
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300nM SB202190，10～15ng/mL PGE2，10～30μg/mL FGF
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7，10～30μg/mL FGF
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10，基础液为Advanced DMEM/F12。2.根据权利要求1所述的一种胆囊癌类器官异种移植瘤模型的构建方法，其特征在于，所述将肿瘤组织消化的消化液配方为1～3％青霉素/链霉素，0.05～0.2mg/mL庆大霉素，0.3～0.8％制酶菌素，1～4mg/mL胶原蛋白酶A，0.05～0.1mg/mL透明质酸酶以及基础液补充余量。3.根据权利要求1所述的一种胆囊癌类器官异种移植瘤模型的构建方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王积栋，冯飞灵，许凤，康嘉伟，
申请(专利权)人：上海万何圆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：